有勁的基因資訊

人類乳突病毒Human Papilloma virus(HPV)是一種分子較小直徑約55nm的DNA病毒，目前人類乳突病毒有一百多種基因型，不同基因型的人類乳突病毒引起的疾病種類不盡相同，其中以30~40種類型的人類乳突病毒會透過性行為傳染到生殖器或周邊皮膚，而這些種類當中又以10~15種最容易引起子宮頸癌與其他生殖道癌，例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68
被稱為高危險性病毒。人類乳突病毒除了導致大家所熟悉的子宮頸癌之外，在流行病學與分子生物學研究報告中顯示人類乳突病毒也可能造成頭頸癌的發生。
 
加拿大知名生物學家在Human Papilloma virus研究中

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在哺乳動物，DNA 甲基化通常發生在CpG dinucleotides 上，而且是研究基因調控和疾病誘發重要的epigenetic mark 。詳細的了解 DNA 甲基化程度和位置對於研究發育 (development) 和疾病型態 (disease phenotype) 有很大的幫助，尤其以癌症來說，甲基化的研究可以提供診斷的 biomarker。在哺乳動物的DNA大約有~1 % 的 5’-methylcytosine (5MeC), 其中這甲基化有70~80% 位於CpG dinucleotides。但是DNA methylation pattern 在每一個個體或是組織會有所不同，是處於一種動態的模式，這樣的情況讓基因的定序常常有偏差的情況發生。
  近年發展了三種研究 DNA 甲基化的主要方法:
1. Chemical conversion with sodium bisulfite
2. Digestion with methylation-sensitive restriction enzymes

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       真核生物的genome size較原核生物大，且有許多條大小不一的染色體，所以在進行optical mapping及定序資料的組裝上較為困難。若能將真核生物的每個染色體獨立的分離出來，再分別進行定序或解出restriction enzyme map，對序列組裝上會有相當大的幫助。
將不同大小型態的染色體分離出來的技術一直以來都有許多研究團隊在開發，其中的技術包含使用micromanipulator配合雷射切割、使用原子力顯微鏡atomic force microscope nanolithography及流式細胞儀Flow cytometry，其中流式細胞儀Flow cytometry是被認為分離效果較佳的技術。

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DNA Genotek^® OrageneˑDNA ( OG-500 )DNA Collection Kit在臨床上的應用
 
在實驗室大家應該都有使用過DNA萃取套組 ( DNA isolation ) 的經驗，大部分的DNA萃取套組都需要一定的樣品量或檢體才可以萃取到足夠量的DNA，並且會因樣品取得的難易度及樣品保存的效果而影響後續實驗的結果好壞，倘若萃取出來的DNA品質還要符合生物晶片 ( Microarray ) 或次世代定序 ( Next generation sequencing , NGS )等實驗的樣品要求則難度相對提高許多。

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科學家們發現在不同環境發現的古生物化石 DNA，其受損降解的情形其實是很類似的，使用次代定序的平臺研究古代 DNA 能夠直接的檢測許多現象，為人熟知的例如：嘌呤丟失作用 (Depurination)、胞嘧啶的去胺基作用(Cytosine deamiation)、fragmentation rate……等等。

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之前我們在”跨越定序平台的迷思”一文中提到，同一個library在Illumina的兩個不同定序機台 (Miseq 及 Hiseq2000) 定序的結果並沒有特別的差異。然而，同一樣品在不同 library 製備方法下，會產生出不同的定序結果嗎?
        2012 年 Joern Toedling 的研究團隊以 small RNA sequencing 做了一系列相關的研究，其將老鼠的 ES_XX (embryonic stem cell line female) 及 ES_XY (embryonic stem cell line male) 做為比較的對象，以不同平台的 small RNA library 的製備法處理樣品，並且分析其定序資料，不同製備法配合樣品的資訊如下表。
  作者以 pair-wise Spearman rank correlation 分析上表十個樣品間 miRNA reads 數量的 correlation，並且將結果以 heatmap 形式呈現(如下圖)

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即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction，簡稱為Real-time PCR)，又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應(Quantitative real time polymerase chain reaction，簡稱為Q-PCR)。Q-PCR是藉由PCR擴增原理將DNA放大的同時並達到即時定量之結果，若使用傳統PCR方法來定量的話是較費時費工又容易汙染，因此Q-PCR已經廣泛使用在定量這方面。
 
目前Q-PCR常用化學物質大致上可以分為：非專一性化學物質(SYBR Green )與專一性化學物質(TaqMan probe)。分述如下：

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不管是測DNA、RNA或是protein濃度單位大多以ng/μl為準，很少會以nM為單位。因此對於這方面的單位換算來說許多人都很陌生，也因為陌生可能導致遺忘如何換算或因陌生而不敢接觸，所以在這我們將舉個簡單的例子來說明ng/μl與nM的單位換算方式。
例子1.
      假如DNA濃度是10ng/μl
      DNA size是300bp (DNA每個bp 分子量為650)
      而此DNA的分子量為650＊300＝195000
      因為知道莫耳數=克(g)/分子量，所以可以先計算10ng＝？莫耳
      10ng /195000＝0.000051 n molar
      所以濃度為0.000051 n molar/μl
      因為M＝molar/L，所以在進行單位換算
      0.000051 n molar/μl＝0.000051 n molar/0.000001L＝51nM

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Library construction過程中，DNA及RNA濃度的精準測定是相當重要的。尤其在製備library之前，必須要了解樣品的濃度，才能取出適當總量的DNA或RNA做為製備的原料，若因為濃度偵測的不準確，會導致最後library產物總量不足夠上機定序。目前常見的DNA及RNA濃度測定方法有吸光值測定法、專一性螢光染劑測定法。
 
一.  吸光值測定法
Beer-Lambert law顯示，分子對於特定波長光之吸光程度會隨著分子濃度而有所不同，所以可以藉由測量溶液的吸光程度optical density推估分子的濃度¹。DNA及RNA分子會吸收波長260nm的光，所以可藉由260nm的吸光值換算成濃度(如下圖所示)。此測定法操作簡單且快速，但極容易造成量測的不準確，因為若萃取DNA或RNA的過程中，溶液混有其他也會吸收260nm波長光的物質，常常會造成高估DNA及RNA的濃度，進而影響後續實驗的進行。

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PCR-Free 顧名思義是指不經 PCR 步驟而完成 library
construction。


一般來說 library construction 都須經由 PCR 放大再做定序，放大後的 library 會產生幾種情況：

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