有勁的基因資訊

研究生物基因轉錄體的方法有許多種，而使用次代定序儀系統進行轉錄體定序是目前相當熱門的一種方式，科學家們使用 RNA-seq 分析轉錄體表現主要期望能夠獲得三種重要資訊：1. 了解整個轉錄體構造、splicing 位置以及註解基因的功能。2. 將所有轉錄體的表現量多寡定量。3. 找出 alternative splicing 的可能性方式。

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目前發展成熟而被應用在許多研究的次世代定序技術中，被定序的library 大多為DNA而非RNA(定序原理請參照本部落格先前文章)，在現有的mRNA-seq技術中，需先將RNA反轉錄為DNA，製備出DNA型態的library後，始能執行定序反應。針對mRNA-seq，近日Lira Mamanova團隊以Illumina定序平台為基礎，發展出可直接以RNA library做為定序材料的新技術，名為FRT-seq(Flowcell Reverse Transcription sequencing)，此技術將RNA library注入flowcell內，並且直接在flowcell內執行反轉錄及bridge PCR，FRT-seq能完整保留RNA正負股的資訊(即strand-specific mRNA sequencing)，除此之外，其製備library過程中不需經由PCR的放大，所以可以減少PCR所產生的錯誤(請參照本部落格PCR free文章)。

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在原核生物中，mRNA 只佔全部 RNA 的 1-5%，其餘絕大部分是 ribosomal RNA，因此若要定序 mRNA 首先必須先將 mRNA 純化出來，然而，原核生物並不像真核生物 mRNA 具有 poly A 的結構，因此，無法直接利用 oligo T 將 mRNA 純化出來，如果拿 total RNA 進行定序，那麼定序的效率一定會非常差，因為大部分的序列都來自 rRNA；如何提升原核生物 mRNA 的量，已成為 NGS 系統的重要議題，目前，提升原核生物 mRNA 的量，最主要的方式不外乎分為兩大類，第一類是減少 rRNA 的量(下圖 a 與 b )，圖 a 的方式是利用 rRNA 的 probe 將 rRNA 去除，這也是最常用的方式，然而，去除 rRNA 的效率會與 probe 序列的設計與生物物種有關；圖 b 的方式是利用針對 rRNA 作用的酵素將 rRNA 去除，主要是利用原核生物的 mRNA 5’端有三個磷酸，而此酵素無法對三個磷酸的結構作用，因此，能夠有效去除 rRNA。
 
 

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由於原核生物的 mRNA缺乏poly-A的結構，使得要純化出原核生物的mRNA技術困難度要比真核生物高出許多，目前比較常用的方式是利用hybridization去除rRNA後，再進行RNA的定序，然而，不同的物種去除的效果差異頗大，定序結果中，往往只有大約10-20%的mRNA，其餘大部分為rRNA的序列，圖一為Shaomei He團隊的研究結果，a與b分別來自兩個的環境樣品metatranscriptome的結果，結果可以發現hybridization去除rRNA效果不盡理想，尤其是樣品b，即使利用兩次hybridization，非rRNA的比例也只有11.3%，如何有效降低rRNA比例將是研究員何生物轉錄體的重要課題。
圖一:
 

近年來，Hana Yi研究團隊利用DSN (duplex specific nuclease)來去除library中過多的rRNA序列，發現可以有效提升mRNA的比例到61.1% ，而傳統的hybridization 的方式只有23.3% mRNA(圖二)。

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microRNA(miRNA)是一段長度約22個核苷酸的RNA分子，由DNA轉錄而來但並不會表現成蛋白質。主要的功能為調控動物和植物的轉譯後修飾，很多癌症被發現可能由這些小RNA分子所影響。當miRNA與其被調控基因的binding
target site 鍵結後，會抑制其基因的表現(抑制轉譯)或使其基因轉錄後的RNA序列斷裂。miRNA與基因binding target site通常是落在transcript的3’UTR，以miRNA 5’方向的第2到第8核苷酸(seed區域)與transcript完美鍵結，此外研究發現miRNA的seed區域與基因binding時，可以是G:U
wobble的模式鍵結，或是在seed的區域有少數的核苷酸並沒鍵結(Imperfect seed)；miRNA與基因的binding site也可能落在3’UTR以外的區域。


 

利用NGS的技術來定序miRNA(small RNA)後，可快速大量尋找以前未知的novel miRNA，從NGS的資料我們可以利用一些找尋novel miRNA的預測軟體例如:miRDeep and Mireap，這些軟體可以讓我們得到未知和已知miRNA和其表現量，使我們能夠更清楚了解某細胞或某組織下miRNA表現的多寡，可以減少做生物實驗的時間。了解可能會影響miRNA，其預測miRNA與其被調控的基因位置是一件很重要的事情，較早的預測軟體TargetScan、PicTar可預測target binding site於3’UTR 且seed區域完美鍵結的基因有哪些。隨後發展的miRanda可預測seed區域為G:U wobble的樣式及seed區域並非完美鍵結的情況。而PITA及rna22則可預測target binding site不是在3’UTR的情形。

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相較於傳統的microarray方法，RNA sequencing究竟有著什麼樣的優點，讓我們必須讓我們從microarray轉換到RNA sequencing呢?


RNA seq 不需預先知道genome
sequence，但Microarray 需預先知道genome sequence才能進行。因此，即便是尚未完全解序完成的物種，RNA seq仍能偵測其RNA的表現量。
RNA seq 能偵測到所有表現的基因，就算是尚未被發現的基因，仍能偵測其表現量，故能發現到新的基因; 但microarray對於基因的表現則受限於探針(probe)的設計，對沒被設計到探針(probe)的基因，就沒辦法偵測到其表現量，所以不具發現新基因的能力。

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