有勁的基因資訊

心肌病變可分為擴張型(dilated)、肥厚型(hypertrophic)或限制型(restrictive)三種，而這些心肌病變的臨床表現是依收縮壓或舒張壓的功能障礙而有所不同，現今


擴張型心肌病變普遍被認為是心臟衰竭與心臟移植的問題所在。目前研究顯示，

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使用 NGS 系統應用在物種全基因體上定序上是已發展成熟的技術，然而在真核生物的研究方面，有著高等生物基因體過於龐大複雜的難題存在，在過去，科學家們想研究物種的基因體特定區域時，往往只能小部份的使用 PCR 增幅目標區域並定序之，如今結合上 Exome Capture 技術以及 NGS 系統，能夠讓科學家們專注在研究目標的表現基因上，還能以更便宜的價格，獲得較全基因體定序深度更深的序列資料。
以人類基因體舉例來說，30 億個鹼基對的全基因體序列，Exome 部份僅有其中的 3000 萬，這表示許多科學家們著手研究一項研究主題時，可能僅是對其中 1% 的序列感興趣，因此出現了利用 DNA 雜合原理為基礎的 Exome Capture 技術。下圖為 Exome Capture 的流程圖，我們將製備完成的 DNA library，在鹼的環境下打斷氫鍵變成單股，在加入掛上 Biotin 的單股 DNA Exome probe，使得基因體中的 Exome 部份被這些 probe 雜合上，其後再使用帶有磁珠的 Streptavidin，留下 Exome 洗去不需要的基因部分。除此之外尚有其他三種 Exome Capture 的方式，有的需要 DNA polymerase 參予，不過原理仍大同小異，最重要的部分，仍然是 Exome Probe 的設計，要利用小片段的 DNA (ex: 95 mer) 專一性的抓住較大片段的 DNA (ex: 350 mer)，是需要經過精密的設計以及評估的。 

 
人類有 86％ 的疾病是發生在 Exome 的部分，目前尚有許多罕見的遺傳疾病還找不出致病的基因，它們可能不依循的孟德爾遺傳定律 (ex: Freeman-Sheldon syndrome)，需要全盤性的比對 Exome 部份的基因變異可能性，這個變異性的正確性，深深的被定序的深度所影響，當要確認一個基因變異的 SNP (single nucleotide polymorphism) 的正確性時，需要 8-30 倍的定序深度來支持，而這個可變動要求往往是受限於 Capture probe 的大小，以及經費所限制。除了利用 Exome Capture 技術研究人類疾病，目前這項技術也應用在研究人類的演化上，使用新型的 Primer Extension Capture 方式，自五個尼安德塔人的核酸來源中，成功組合出尼安德塔人 mtDNA。另外一個報導描述尼安德塔人的核酸來源中雜有 99.8% 的微生物 DNA，但利用在人類演化上保留度高的片段當作 Probe，成功的自尼安德塔人嚴重汙染的 DNA 中，找到與人類相近的 88 個片段位置。Exome Capture 的實際應用範圍，還可以更廣，根據研究主題的不同改變 probe 的設計方式，利用這項技術可以幫助科學家們更容易得到一些新的發現。

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ChIP-sequencing是研究蛋白質與DNA互動的一種方法，是利用抗體與抗原結合的特性，將蛋白質與互動的DNA抓下，再透過DNA純化的方法，取得與蛋白質互動的DNA，然後透過次世代定序的技術來得到該DNA正確的序列。
 
其實驗流程為: 進行免疫沉澱，加入對目標蛋白質具高專一性與靈敏性的抗體，抓下蛋白質與其所附著的DNA，透過DNA純化去除蛋白質得到DNA，然後進行定序。
 

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致病性微生物的來源管控及監測對於預防群體感染是相當重要的，傳統上須藉由比較微生物基因體結構上的相似度來找尋感染的源頭，常見的分子檢測方式為PFGE。Optical mapping能在短時間內得到微生物的全基因體限制酶切位圖譜，　因此，在比較不同來源微生物的基因體結構上，能得到比PFGE更精確且詳盡的資訊。目前Optical mapping在管控致病性微生物上，對於找尋醫院內部集體感染抗藥性金黃色葡萄球菌(Methicillin
Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的傳播來源及細菌抗藥基因和毒性基因的分析，皆能提供即時且精確的資訊。


抗藥性金黃色葡萄球菌是醫院院內感染最常見的菌種，免疫力較差的住院患者常一旦被感染後，容易因為敗血症而導致死亡，因此，抗藥性金黃色葡萄球菌在醫院內的感染管控是相當重要的。下圖為以optical mapping找尋感染來源的實際案例，以不同病房內所採集到的抗藥性金黃色葡萄球菌之限制酶切位圖譜，與被感染的患者身上收集到的細菌之切位圖譜做相似度的比較，能準確的找出病人被感染之來源病房，並且得以針對特定病房做消毒及管控，進而達到防止集體感染之目的。
  

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在進行 de novo sequencing 時，假如我們只利用NGS的資料要將全基因體序列組裝起來，通常要非常高的覆蓋率 (coverage) 才可能將基因體組裝起來，但是，如此高的覆蓋率，不但定序費用相當高，而且面對龐大的資料量，組裝所需的硬體需求將是我們所面臨的第一個難題，組裝所需的漫長運算時間，則是另一個難題，此外，組裝錯誤亦無法被查覺。
利用 Optical mapping 可以更有效率地進行 de novo sequencing ，以更低的成本，更快的速度組完全基因體序列。
首先，我們利用 Optical mapping 建立全基因體的圖譜。

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一般在做全基因體比較時，通常會先得到全基體的序列，然後再比較基因體之間的差異。
但是，當我們還不知道這些基因體是否存在差異前，貿然進行全基因體定序，倘若結果未能如我們預期，定序所花費大量的人力、物力與金錢無異是種浪費。
在定序前，我們可以先以 Optical mapping 來分析我們要比較的基因體:

如果基因體間沒有差異，我們就可以節省時間與金錢，不必再做進一步的定序。
如果基因體間存在差異，再進行定序的工作，如此不但工作較有效果，而且Optical mapping 的結果亦可輔助全基因定序的工作，提升全基因體定序的效率。

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菌株分型(strain typing)是分析菌株差異性常用的方法。
過去常用的方法是 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis)，但是PFGE的缺點是

只提供少量的資訊
對於相近菌種的區別性不佳

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Optical mapping 是利用限制酶去裁切單分子DNA，產生單分子DNA圖譜，然後將許多單分子DNA圖譜組裝起來，以得到全基因體圖譜的一種技術。
其實驗步驟如下:
一、以PDMS組成的微流道，利用毛細現象的原理，將DNA拉直，由於微流道下方的玻片為帶有正電之玻片，利用DNA帶負電的特性，將DNA固定在特殊玻片上(正負電相吸)，此時，我們會得到一條筆直的單分子DNA。
 

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