作者:劉祥欽 /有勁生物科技

 

全基因組放大 (Whole genome amplification, WGA) 是進行單顆細胞 (或有限的細胞數) 全基因定序時相當重要的步驟。現行單細胞定序的應用有一大部分是在偵測細胞基因組中染色體套數或是小範圍Mb等級的數量變異 (copy number variant, CNV)。具體而言,胚胎著床前基因診斷 (preimplantation genetic diagnosis, PGD)、基於胎兒細胞的NIPT、以及循環腫瘤細胞的液態活檢 (liquid biopsy of circulating tumor cells, CTCs) 等都需要以單細胞定序的技術偵測數量變異。由於這些應用的目標細胞取得的難易程度不一,所需的技術也各不相同,因此今天暫且將這部分的問題放在一邊。取得目標細胞後,如何從中得到足量的DNA會是接下來要思考的問題。一般來說,從一顆細胞取得的DNA只會有picogram等級的量,而製作定序用的library則需要nanogram等級的DNA,所以,必須以WGA的方式將DNA均一的放大。

 

如果要成功偵測數量變異,在WGA這個關鍵步驟可以容許序列複製時發生錯誤,但序列間的比例必須一致。現行的WGA方法中,以PCR為基礎的作法因為放大時的均質程度較佳,因而較適合用於偵測數量變異。目前已有數家廠商推出PCR-based WGA套組,但究竟何種用於偵測單細胞基因組中的數量變異仍莫衷一是。

 

2017年在Nature旗下的Scientific Reports刊出了一篇文章1,以偵測單細胞基因組中數量變異的正確度為基準,比較了市面上兩種廣被使用的WGA套組 (REPLI-g single cell WGA及Ampli-1 WGA) 以及兩種剛面市的生力軍 (Picoseq及DOPlify WGA)1。先說結論,四種kit都不錯,用這四種kit放大出來的DNA做library並定序,結果大部分的數量變異在放大後都能被找到。圖一是以1Mb為單位偵測數量變異發生位置的結果,A、B、C、D各是以REPLI-g、Ampli-1、DOPlify、Picoseq所放大出來的DNA進行定序後的結果。它們放大的目標DNA皆是來自同一個已知數量變異位置的細胞株 (lymphoblastoid Loucy cell line)。圖中的每一個小點都是均質化之後的相對定序量,所以定序量超過或低於標準便被視為數量變異(在圖中被標示為紅色或藍色的區塊)。結果顯示,四種方法找到的數量變異大致上雷同並與已知的位置相符,所以四種kit皆能符合預期的需求。

 

 

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圖片來源:Deleye, L. et al. Scientific Reports 7:3422 (2017)

 

然而進一步細看,還是可以發現它們在不同的面相各有優劣,例如REPLI-g可放大出高於其他kit數十倍的DNA,可讓實驗不致因DNA不足而捉襟見肘,但相對的導致偽陽性的比例明顯高於他種kit。值得一提的是從DOPlify和Picoseq這兩種kit放大出來的DNA可以找到所有已知的數量變異,但從REPLI-g及Ampli-1放大出來的DNA則有機會漏掉13號染色體上一段26 Mb的數量變異。就操作時間來比較,DOPlify因為只需兩步驟就可在三小時內完成實驗,相較於REPLI-g與Ampli-1的耗時費工,則有較強的優勢。至於要選擇哪一種,就要看實驗者的需求囉!

 

參考資料

1       Deleye, L. et al. Performance of four modern whole genome amplification methods for copy number variant detection in single cells. Scientific Reports 7:3422 (2017).

 

 

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