有勁的基因資訊

作者：劉祥欽/有勁基因

　　PCR(Polymerase Chain Reaction; 聚合酶連鎖反應)可以在生物體外快速擴增微量的特定DNA片段，是一種非常普及的分子生物學實驗技術。PCR擁有高敏感度及高效率的特性，且容易上手、價格低廉，因此廣泛地被應用在生命科學、醫療診斷、法醫鑑識、以及食安與環境檢測等領域。因為「快速」、「擴增」、「微量」的度量形容還蠻抽象的，所以下面就來舉個實際的例子說明。

　　假設我們有1千條DNA模板，現在利用跟DNA模板上面位置A及B序列一樣的兩條引子(primer)去黏結模板，以標示出想要擴增的序列起始和終止位置；然後加上耐熱的Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)，於鎂離子緩衝液中及溫度反覆改變的條件下，這1千條DNA上兩個引子標示處之間的片段就能以每回合兩倍的幅度擴增。30個回合之後，DNA片段就會從1千條迅速變成1兆零73億條。這樣的增幅，如果擴增對象是長度500 bp的DNA，可能只需要1小時便能完成。

　　由於PCR本身的實驗條件很容易控制，所以當結果不佳的情況出現，倘若PCR實驗條件穩定，同時也有對照組可證明實驗是成功的，那麼實驗結果不如預期通常都會歸因於DNA模板的品質不佳。

　　DNA模板的品質判斷，定性或定量上可以用NanoDrop、Qubit、Bioanalyzer、或直接用膠體電泳的方式來進行；這些方法各有優缺點，但因不是本篇的重點，就不一一贅述。鋪梗鋪了這麼久，就是要跟大家分享：除了DNA本身質和量的監控之外，其實在DNA溶液中還有另一個可能會影響PCR結果的因素，卻一直很少被提及，那就是--RNA的含量。

　　DNA和RNA同為核酸，因此在純化時經常會出現分不開的情況。RNA裡有DNA通常是比較不被允許的，因為這會干擾到後續RT-PCR(反轉錄聚合酶連鎖反應)的結果，所以在純化RNA時就會先用DNase(去氧核糖核酸酶)除去DNA。而DNA裡有RNA….照理說應該是不會怎樣啊？一般而言，DNA聚合酶如果沒有處於特殊的緩衝液(buffer)環境下，是不會有反轉錄酶(Reverse transcriptase)活性的，因此混在其中的RNA並不會被當作模板去進行擴增，不至於會影響到PCR結果。況且，一般在常溫或高溫的環境下，無所不在的RNase(核糖核酸酶)也是會積極消滅RNA的！這就是為何混在DNA裡的RNA，通常可以被忽略不管的原因。

　　然而螞蟻雖然小，聚在一起還是有可能搬得起大象的。RNA看似無害，其實它一直默默地在偷抓鎂離子。RNA與鎂離子會形成一種雙齒、穩定的螯合結構(Bidentate RNA–magnesium clamps；詳見圖一）^1、2。一旦這樣的結構形成，不僅會消耗掉PCR緩衝液中作為輔酶的鎂離子，也會讓RNA變得更穩定、更不容易被RNase分解掉。在Thermo Fisher Scientific的PCR說明網頁³上，有發布一些鎂離子與PCR效率間相對關係的實驗結果：鎂離子濃度一旦降低時，PCR的效率便會明顯受到影響。因此，當有大量RNA混在DNA水溶液中時，的確有可能干擾PCR的進行。

　　關於這個議題，TOYOBO的protocol⁴也有明確指出，一旦RNA總量高於100 ng時，就會影響PCR的實驗結果。據此經過換算後，我們得知：當RNA與DNA的比例大於2比1時，PCR就有可能受到RNA的干擾，而影響結果的判讀。

　　寫到這裡，要再一次強調：進行PCR實驗時，做為模版的DNA水溶液裡不能有「太多」的RNA，否則PCR受到干擾，擴增產物就會變少。那RNA怎樣才叫做「太多」呢？根據TOYOBO的建議是：RNA對DNA的比例不要超過二倍。

　　對了，如果想要一勞永逸，抽取DNA時不妨加入RNase分解RNA的步驟，這樣就不必擔心RNA會對PCR實驗造成干擾了。

圖一、RNA與鎂離子形成的雙齒螯合結構示意圖

灰色區域為由十個原子形成的雙齒螯合結構(Bidentate RNA–magnesium clamps)。當RNA上的磷酸根進入鎂離子的第一殼層便會形成此種結構。(圖片出處：Petrov, A.S., et al. RNA. 2011 Feb; 17(2):291-297.)

參考文獻

1. Bowman, J.C., Lenz, T.K., Hud, N.V., Williams, L.D. (2012 Jun). Cations in charge: magnesium ions in RNA folding and catalysis. Current Opinion In Structural Biology. 22(3):262-272. Retrieved from https://doi.org/10.1016/j.sbi.2012.04.006

2. Petrov, A.S., Bowman, J.C., Harvey, S.C., Williams, L.D. (2011 Feb). Bidentate RNA–magnesium clamps: On the origin of the special role of magnesium in RNA folding. RNA. 17(2):291-297. Retrieved from https://doi.org/10.1261/rna.2390311

3. Thermo Fisher Scientific Inc. (2017). PCR Setup-Six Critical Components to Consider. Retrieved from https://www.thermofisher.com/tw/zt/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-component-considerations.html

4. TOYOBO Inc. (2017). Instruction Manual KOD -Plus- 1207. Retrieved from https://www.toyobo-global.com/seihin/xr/lifescience/support/manual/KOD-201.pdf