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作者：沈淑華/有勁基因

古早傳統忽略了求子其實不該只是女方的責任，而是夫妻雙方的責任，因此女性總是背負著傳宗接代的壓力。隨著時代變遷及科技的發達，慢慢地大家的觀念也已經改變，並瞭解到不孕症也有可能會發生在男性身上。男性不孕症的起因可歸類為先天和後天兩大類，本文要介紹大家認識的是屬於先天性不孕症的「克林菲特氏症(Klinefelter′s syndrome; 47XXY)」。

一般正常人的體染色體有22對，加上另一對可以決定性別的性染色體共是23對。換言之，男性有22對體染色體與一對性染色體(X染色體+Y染色體)，女性則有22對體染色體與一對性染色體(X染色體+X染色體)；如果以核型來標示，正常男性為46,XY，女性為46,XX。克林菲特症是在1942年由克林菲特醫師發現，罹患此症的男性其細胞中多了一條X性染色體，核型標示為47,XXY¹。那麼，到底是什麼原因造成這樣的結果？患者早在其母受精懷胎時就因為獲得47,XXY受精卵而注定命運了，這種受精卵主要是由不完全減數分裂所產生的精子或卵子，與正常的精子或卵結合形成；那個多出來的X性染色體有可能源自父親，也有可能來自母親。相較起來，高齡夫妻生子尤其容易發生這種狀況²。

克林菲特氏症患者的臨床表現包括精液中無精(無精症；Azoospermia)、曲細精管(seminiferous tubules)發育不全、體内荷爾蒙異常與睪丸較小等等。下方圖片的作者在他們的相關研究中收集了數位克林菲特氏症患者的案例³，探討這些患者體内荷爾蒙的異常情況。

圖一、克林菲特氏症患者體内荷爾蒙異常的情況

作者：尤冠景/有勁基因

單細胞RNA定序(Single cell RNA Sequencing; scRNA-seq)是一種利用高通量定序方法對單一細胞RNA進行擴增與定序的技術，可以幫助微觀、了解和鑑別不同類型的細胞及其基因的表現。單細胞RNA定序的原理是在微流體裝置設置三個通道(如圖一所示)，利用流體技術讓細胞先與裂解緩衝液(Lysis buffer)中鑲嵌著DNA primer的微粒(microparticle)會合；當流經含油的通道時，細胞會被油滴一個個隔開，以一個細胞搭配一個微粒的組合形成各自獨立的微滴(droplet)；隨後微滴內的細胞迅速被裂解緩衝液分解(cell lysis)並釋出mRNA。微粒上所鑲嵌的DNA primer各自標誌了不同的標籤序列(barcode)以及可用來抓取mRNA的Oligo(dT)序列；當微粒抓取完mRNA後就會打破微滴，進行反轉錄與模版交換，然後進入PCR程序。RNA擴增完成之後，每個細胞的RNA library都會包含不同的標籤序列，定序分析時便可透過這些標籤序列去區分每個細胞的RNA表現狀況。詳細過程如圖一所示¹。

圖一、單細胞RNA定序流程圖

(圖片來源：Macosko, E.Z., et al. Cell. 2015 May;161(5):1202-1214.)

近年來，單細胞RNA定序這個技術的發展已經進入成熟階段，為細胞發育與再生醫學、腫瘤微環境、免疫學相關研究、藥物開發、精準醫療等領域帶來重大的突破與發現。今年中國科學院的一個團隊便發表了利用此方法觀察川崎氏病治療前後的免疫反應狀況。

林修平/有勁基因

家裡有毛小孩的爸媽們，你們是否曾為了選擇飼料，看著架上琳瑯滿目的商品傷透腦筋呢？生怕買到製程或衛生有問題的飼料，搞得毛孩們上吐下瀉；尤其毛孩若是天生體質過敏，毛爸毛媽們一定會更仔細審視飼料的成分來源，以免寶貝們吃了發癢東抓西撓，甚至嚴重過敏，弄到得去獸醫院報到。

針對毛孩飼料的安全及衛生，歐盟特別在一般食品法規Reg(EC) 178/2002¹及飼料、飼料添加劑和預混料生產標準Reg(EC) 183/2005²中明訂了規範。包裝上的標示因此成為飼主們判斷食材資訊的唯一管道，然而對於那些已壓製成型的飼料顆粒或是混合過的泥狀鮮食罐頭，消費者們終究無法實際看見食材的原貌。例如包裝上雖然標示著「牛肉蘋果」、「鮭魚馬鈴薯」等斗大字樣，飼料看起來又哪裡有這些食材的一點影子？先不論包裝標示與內容物不相符是否是廠商誤植或故意以次充好壓低成本所致，近年來標示不實的案件不減反增，因此監管單位的當務之急就是找出更準確有效的檢驗方法。

利用次世代定序(Next Generation Sequencing; NGS)去檢驗食品的來源成分其實已經行之有年，其概念是使用基因條碼(DNA barcoding)的方法對檢體內容進行物種分類，進而分析成份來源。有勁部落格文章《條碼 (barcode) 應用對於次世代定序的貢獻》及《利用NGS平臺揭開中藥的神秘面紗》即曾針對基因條碼與微基因條碼方面的技術應用加以闡述。然而針對寵物飼料的NGS定序分析過去卻鮮有相關的研究報導。2020年義大利的一個團隊發表了利用微基因條碼(DNA mini-barcoding)技術，以粒線體中細胞色素C氧化酶基因(cytochrome c oxidase subunit 1 gene , CO1 gene)為標的去分析市面上18種飼料的肉類成分種類的研究(詳見表一PF1~PF18)，對照組是2種實驗室自行混合配製的飼料(Mix1及Mix2)。結果如表一所示。³

表一、利用次世代定序技術對市售及自製飼料中肉類成分種類的驗證結果

作者：黃啓銘/有勁基因

新型冠狀病毒肺炎(Covid-19)疫情自2020年至今肆虐全球，由於有效的治療藥物及療法未問世，注重個人衛生與疫苗注射仍是目前防範新冠肺炎的黃金標準；然而狡猾的新冠病毒(SARS-CoV-2)仍不斷突變，以致疫苗保護力不如預期。世界衛生組織迄今已經追蹤研究的變異病毒株就有9種¹，新冠疫情預期還會持續並演變成人類與病毒的長期攻防戰；該如何有效分配醫療資源使之不致耗竭已然成為新冠疫情防疫的重要課題之一。

各式各樣的新冠肺炎相關研究中，「新冠肺炎重症與基因體之間的關聯性」是研究人員感興趣的主題之一。一般來說，年長者與慢性病患者被新冠病毒感染後比較容易引發重症² ； 而年輕人就算看似身強體壯，被感染後，也可能因為自身的基因較具「易感性」而引發重症³。究竟什麼樣的人其基因較具易感性呢？關於這方面的研究，目前針對ACE2 (血管收縮素轉化酶2)、人類白血球抗原(HLA)、以及血型等三類標的基因有較多深入的探討⁴。以下就來為大家一一介紹。

ACE2 (Angiotensin-Converting Enzyme 2；血管收縮素轉化酶2)，是RAS (renin-angiotensin system；腎素-血管收縮素系統) 的一部分，其作用在維持人體體液的平衡；不巧的是，ACE2剛好也是新冠病毒藉以進入人類細胞的細胞膜表面受體。ACE2的轉化酶活性已知和病毒的感染力有正相關的表現⁵。根據Cao等人的研究⁶，ACE2基因上面目前已經發現4個對ACE2活性有影響的SNP(single-nucleotide polymorphism；單核苷酸多型性)變異位點。有一小部分的人，因為他們的ACE2基因上發生了這些SNP位點變異，以致ACE2活性降低，卻正好因此比較能抵禦新冠病毒的入侵。另一方面，ACE2的表現基因就位於X染色體上，由於女性帶有兩個X染色體，因此相較於男性，女性ACE2基因發生SNP位點變異的機率就比較高，這或許有助解釋為何女性感染新冠肺炎或因此引發重症的比例比男性來得低的原因⁴。

HLA (Human Leukocyte Antigen；人類白血球抗原)又稱MHC (Major Histocompatibility Complex；主要組織相容性複合體)，其與人類免疫反應和免疫調節有關，在多種病毒的感染機制中皆佔有一席之地。Langton研究團隊在今年四月發表的論文中指出⁷，特定的HLA對偶(等位)基因會影響人類受病毒感染引發新冠肺炎重症的機率。他們利用次世代定序(NGS)分析了兩群歐裔族群的HLA基因型，一群為新冠肺炎重症患者，另一群為血液抗體呈陽性的無症狀帶原者。研究結果發現，無症狀帶原者的基因中帶有HLA-DRB1*04:01對偶基因的比例是重症者的3倍。換言之，基因中若帶有HLA-DRB1*04:01對偶基因，似乎能夠預防重症的發生，甚至不會出現症狀。

作者：葉佳妤/有勁基因

目前用來評估中樞神經系統腫瘤的工具有腦脊髓液細胞學、核磁共振以及腦部活檢；但這些工具都各有其限制性，例如：腦脊髓液細胞學敏感性不足、核磁共振特異性不佳、以及腦部活檢具侵入性等等，因此需要發展出更好的方法去診斷評估患者中樞神經系統的腫瘤。各種嘗試中，有一項被認為甚具潛力的方法，就是以腦脊髓液(Cerebrospinal Fluid; CSF)中的循環腫瘤DNA(Circulating Tumor DNA; ctDNA)當作生物標記去評估中樞神經系統的腫瘤，這個方法簡稱為CSF-ctDNA分析法。不過，這方面的研究目前仍不多，美國德州Shah研究團隊今年發表的期刊論文¹是其中之一；該研究嘗試為中樞神經系統腫瘤的評估尋找更適切的辦法，包括：(1)萃取CSF-ctDNA的最適方法，以及(2)對「CSF-ctDNA內的變異與中樞神經系統腫瘤之間關聯性」進行分析的最佳方法。

Shah團隊在研究中所採用的是Thermo Fisher公司所生產的商業化試劑套組「Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay(泛癌無細胞分析試劑套組)」。從全血血漿中萃取出游離DNA(Cell-Free DNA; cfDNA)後，利用這個試劑套組可以將萃取出來的cfDNA製作成Library DNA(文庫DNA)，然後透過次世代定序(Next Generation Sequencing; NGS)去偵測與分析cfDNA上52個與許多癌症相關的位點突變情形；但研究指出，將此試劑套組應用在中樞神經系統腫瘤患者血漿cfDNA變異偵測與分析上的實際效果並不佳。至於這個試劑套組能否應用在中樞神經系統腫瘤患者的CSF-ctDNA變異偵測與分析，則尚不清楚，因此Shah團隊做了以下測試，以便進行效果評估。

Shah團隊先以10位非中樞神經腫瘤患者的腦脊髓液當對照樣本，使用市面上四種商業化萃取試劑套組來對樣本中的游離DNA進行萃取，以便找出對CSF-cfDNA萃取效果最佳的試劑套組(見圖一A)。這四種試劑套組包括兩組自動化萃取試劑—Qiagen公司的QIAsymphony DSP Circulating DNA (QDSP)和Promega公司的Maxwell RSC System (RSC)，以及兩組手動萃取試劑—Qiagen公司的QIAmp Circulating Nucleic Acid (QCNA)與Thermo Fisher公司的Magmax Cell-free Total Nucleic Acid (MTNA)。比較結果發現，Qiagen的QCNA能萃取到的量最多，Thermo Fisher的MTNA試劑套組萃取到的CSF-cfDNA量最少。

接著，Shah團隊使用萃取效果最好的QCNA試劑套組去萃取38位中樞神經系統腫瘤患者(其中10位為原發性、28位是轉移性腫瘤患者)的CSF-ctDNA；如圖一B所示，萃取時使用愈多的腦脊髓液樣本，可萃取到的CSF-ctDNA就愈多。

作者：張家豪／有勁基因

有勁部落格文章《Patterned Flowcell平台的重複讀取問題》中曾提到：HiSeq 4000平台需要尋找文庫(library)的最佳上機濃度進行定序，不然會容易出現資料「重複讀取(duplicate reads)」的情況。那麼有沒有工具可以計算出定序資料中duplicate reads的實際比例並且將之移除呢？答案是：有的。本文會使用表一中的定序資料來為大家介紹兩種可供利用的軟體工具⼀FastQC以及fastp。

首先來介紹下表一定序示範資料的背景概況。duplicate_R1.fastq和duplicate_R2.fastq兩個定序檔案是「雙端(paired-end)定序資料」^備註1，共有30條序列 (表一中的read1到reads15)。筆者特意為30條定序資料設計了下表中(A)到(E)五種不同的重複讀取狀況，以便介紹FastQC以及fastp兩種軟體工具的計算方式及進行效能的評估(詳見表一與圖一)。

表一、本文定序示範資料簡介

測試樣品名稱

作者：趙宇翔/有勁基因

台灣疫情在大家努力下雖然逐漸降溫，但秋冬流感好發季節將至，加上新冠病毒突變率高且有無症狀感染者存在，在疫苗覆蓋率仍未達預期的現在，如何提高檢測效率並降低醫療量能損耗，仍是一大考驗。

截至目前，新冠肺炎病毒檢測的標的物大約有以下幾類：抗體(利用病毒重組蛋白去檢測血清內的抗體)、抗原(利用單株抗體去偵測病毒蛋白) 及核酸(直接偵測病毒RNA)。市面上常見的快篩試劑其檢測標的物多是病毒抗原，而我們常聽到的確診依據：定量反轉錄聚合酶連鎖反應(Quantitative reverse transcription PCR，簡稱RT-qPCR )，所檢測的則是病毒的核酸。

其實新冠病毒核酸檢測的方法並不只限於RT-qPCR一種，我們還可以透過Droplet Digital PCR(ddPCR)、次世代定序(NGS)、恆溫環狀擴增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification; LAMP)及Microarray等方法去進行檢測。目前的主流篩檢策略是RT-qPCR核酸檢測搭配快篩。RT-qPCR具有自動化程度高、靈敏度高、特異性強、速度快(最快4-5小時可得到檢測結果)等優勢，在目前疫情環境下，可說是主要的感染確診方法。

對於新冠肺炎病毒的檢測方法，NGS檢測似乎很少被提及。目前疫情下的NGS技術多半是用在病毒學術研究，但，難道沒有已核可的NGS檢測試劑可提供篩檢使用嗎？其實，illumina早在2020年6月就已經開發出「COVIDSeq」，並成為第一個取得美國FDA 緊急使用授權(EUA)的NGS新冠病毒檢測試劑¹。到了2021年3月，Oxford Nanopore Technologies開發的「LamPORE」和Octant開發的「SwabSeq」也都列入核可名單²。那麼，究竟為什麼NGS技術至今仍未被大規模用於新冠病毒篩檢，而是用在病毒監測與學術研究上呢？

Written by Tiffany Chen

In this day and age, the advances in genetic technologies have allowed us to learn more about our genetic history. Companies such as 23andme and Ancestry claim that they have genetic testing services provided to help people to explore their ancestry and the origins of their traits with a simple way for instance taking a saliva sample. Saliva sampling is the most common method to collect DNA samples, as it provides a significantly higher DNA yield than other sample collecting methods (e.g. buccal swabbing). Once the DNA samples are collected, service providers can proceed genetic testing, and provide customers clues to trace the origins of their facial features and ancestry. Nevertheless, review feedbacks always cite both positively and negatively.

Well, negative side first. After spending a fair amount of money on genetic tests, some customers found that they cannot use the results directly for medical purposes, and thus there is no other way to utilize your testing results except being alerted about your health condition. Moreover, in regard to ancestral information, the accuracy of genetic testing analyses that most service providers can offer seem insufficient, especially for Asian genetic tests. Data taken from people of Asian descent are significantly less than those from people of European descent, the specificity of genetic testing results are therefore lower for Asians.

 Nevertheless, the majority of the public still prefer genetic testing for the simple way of sample collecting it adopts. Learning that you are at a lower risk for certain diseases helps to ease anxieties about health issues after all. On the other hand, learning that you are at a higher risk for certain diseases alerts you to pay more attention to your health condition. Thus, issues such as the insufficient accuracy do not actually discourage people from taking genetic tests.

Personally, I would like to know more information about my own DNA. After watching many online videos about genetic tests and descent origin exploring, certainly makes me curious about the genetic heritage of myself. Not only can these tests alert me to my health conditions, but they could also tell me where I am originated from with my DNA and my own physical features. Genetic testing technologies have been improving overtime by accumulating more data and reaching higher standard of specificity. I hope that databases on Asian genetic information will soon reach to the similar level of European genetic databases, so that Asian customers are, too, able to examine and connect to their own genetic heritage.

作者：許柏洋/有勁基因

      新冠肺炎疫情在全球持續延燒，由於該病毒易變種的特性，不僅疫苗研發，治療藥物設計方面也同樣遭遇瓶頸。不過，賓州州立大學團隊近來利用新冠病毒特性合成出缺陷干擾病毒，這個方法似乎為此疫病的治療打開了另一個希望的大門。¹

RNA病毒經常會發生基因體片段缺失的狀況，這些帶有缺失片段的病毒顆粒因編碼序列不完整、本身無法產生蛋白質外殼而失去感染力，然而它們仍能藉由包裹其他正常病毒所製造出的蛋白質外殼去感染宿主，並進行後續的病毒複製與釋出。由於這些有缺陷的病毒與正常病毒之間會互相競爭蛋白質外殼包裹與進行複製的機會，因而會干擾正常病毒在宿主細胞內的感染機會，所以又被稱為「缺陷干擾病毒(defective interfering virus)」。

冠狀病毒經常出現這樣的缺陷干擾病毒，這些缺陷干擾病毒其實也曾經被用來進行病毒基因體上功能位置的定位研究²。而這次，賓州州立大學的研究團隊是去合成一段人造的缺陷干擾病毒基因(以下簡稱DI)，將其與正常的新冠病毒一起拿去感染宿主細胞並產生競爭，然後觀測DI能否成功干擾新冠病毒的感染。

研究團隊先觀察參考了天然生成的缺陷干擾病毒序列，並從中擇選出三組保守序列(conserved sequences)片段，分別是(1)與病毒複製相關片段；(2)與蛋白質包裹有關的序列區；以及(3)有研究結果指出能提升複製效率的片段，然後合成包含此三組片段的DI基因(簡稱為DI₁)。此外，將和感染有關的片段二剔除，合成另一個DI基因(簡稱為DI₀)，作為實驗對照。 接下來 ，將合成的DI基因和新冠病毒株經胞外轉錄(In vitro transcription)後去感染Vero E6細胞株(綠猴腎細胞系，常用於病毒感染研究)，再利用qRT-PCR去檢測病毒量。

作者：張益祥/有勁基因

      我們在做微生物菌相分析時，經常接觸到兩個名詞⼀微生物相(microbiota)和總體基因體(metagenome)，這兩個詞彙時常被大家搞混導致誤用，所以作者很貼心的用以下圖文來解說給大家，如圖一。

圖一、微生物相和總體基因體的比較

(a)微生物相僅對微生物的16S rRNA序列片段進行分析，預測並鑑別環境中可能含有的微生物物種。(b)總體基因體是對微生物的整個基因體與基因進行分析，其中也包含了質粒等物質在內。(圖片來源：Whiteside, S.A., et al. Nature Reviews Urology. 2015 Feb; 12(2):81-90.)

總體基因體的定序策略分成兩大類：全基因體霰彈槍法(whole genome shotgun sequencing)以及16S目標區間定序 (16S targeted sequencing)。16S目標區間定序(16S targeted sequencing)的部分可以去閱讀有勁部落格文章《淺談總體基因體學16S rRNA定序與資料庫》，就不在這邊敘述。今天我們就來談談全基因體霰彈槍法。

作者：徐嘉妤/有勁基因

　　新生兒剛出生沒多久就會排便，但出生前又沒被餵食，便便從何而來呢？其實媽媽在懷孕20周之後，胎便就開始在胎兒腸道中慢慢生成了。胎便(Meconium)呈墨綠色，主要成分包括腸壁脫落的上皮細胞、腸道分泌物、膽汁黏液、胎毛、胎脂、及被吞嚥入肚的羊水。對於胎便，我們除了確認其顏色對不對外，還能從中獲取什麼有用的資訊呢？

　　2021年Cell Reports Medicine期刊發表的一篇研究提出，藉由分析新生兒胎便中的代謝產物可以預測未來罹患過敏性疾病的機會。為了探討胎便代謝物與過敏反應之間的關聯性，研究人員從Canadian Healthy Infant Longitudinal Development(CHILD)研究計畫的950名健康嬰兒中選出具臨床統計代表性的100名，進行糞便早期樣本(年齡中位數為3個月)與晚期樣本(年齡中位數為1歲)的分析。¹

　　下圖一中的CTRL是無過敏反應的健康組(對照組)；Atopy是有出現Ig-E誘發型(IgE-mediated)過敏現象的過敏組。3個月齡無過敏狀況的新生兒健康對照組共計37名(CTRL; n=37)，另外63名在第3個月時就已經有過敏狀況的紀錄(Atopy; n=63)。如圖一(A)所示，根據3個月大新生兒早期糞便樣本中細菌的α多樣性(alpha diversity)分析發現，相較於健康兒，過敏兒的擴增子序列變異豐度(Amplicon Sequence Variants Richness; ASV Richness)明顯偏低(p = 0.01)。

　　為了進一步確定影響微生物菌相發展的可能原因，研究人員將這些新生兒當初剛出生時所收集到第一次排出的胎便樣本，拿來分析其內的代謝物豐度，以估計胎便中微生物菌相的多樣性，如圖一(B)所示。令人在意的是，過敏組新生兒剛出生時所排出的胎便，其代謝豐度便已明顯較健康組來得低(p=0.02)；證明新生兒剛出生時，體內的微生物菌群就已經發展成，並影響了之後免疫系統反應的發展。此外，圖一(C)的統計結果也證明胎便中的代謝物豐度與微生物菌相豐度，和過敏反應的發展有關聯，豐度越高，越不會發展出過敏反應。