有勁的基因資訊

近年來，應用NGS定序技術於RNA層面的研究，給予科學家全面性分析及定量生物體中的不同類型的RNA (例如:mRNA, long non-coding RNA, miRNA, rRNA..等)。進而讓我們更了解基因型 (Genotype)及表現型 (Phenotype)之間的關聯性。Monika Stefaniuk在2015年回顧了近幾年多個團隊使用RNA-Seq分析馬的研究成果，主要可分為三個面向，(1) Gene expression profiling (馬的基因表現譜)；(2) Physiological state (馬的生理狀態) ；(3) Hereditary diseases (馬的遺傳疾病)
 

多形性膠質母細胞瘤(GBM)，又稱為Malignant astrocytoma, gradeⅣ astrocytoma 或Glioblastoma。是最常見且惡化性很高的原發性腦瘤，是死亡率最高的一種，有中央壞死和新生血管的特徵。所有年齡都有可能罹病，不過GBM好發於中晚年，男女發生的比率約為3:2。每年平均新增200~300案例，GBM佔所有顱內腫瘤約12~15%。雖然診斷和治療技術飛速發展,但手術預後狀況非常糟，容易對放療與化療產生抵抗性，腫瘤縮小的效果有限。病人多在診斷後一年內死亡(9~12 months)。單單只有手術治療，中期存活約僅有3-4個月；加上手術後放射治療，可延長至10個月。手術後放射治療及化療藥物Carmustine(BCNU)，可將存活時間再延長一些至一年，不到5%的病患能存活5年以上。GBM的增殖是一個多步驟的過程，受到很多因子調控。控制細胞增殖、細胞死亡和遺傳穩定性有關的許多基因，這些基因的表現程度受到影響和改變。

微小RNA:MicroRNAs (miRNAs)是真核生物中廣泛存在的一種長約18到25個核苷酸的RNA分子，透過 miRNA 與 mRNA(message RNA) 的 3' UTR 區域結合，抑制轉譯作用或降解 mRNA來降低基因的表現，達到調控基因表達的目的。許多研究推論miRNA可能參予癌化過程。是新興的細胞信號的重要調節劑，包括在癌細胞增殖分析腫瘤與正常組織，或是不同腫瘤型態之間miRNA 表現的差異，可以找到與癌症高度相關的miRNA，因此推論miRNA可能是癌化過程的一個導因。作為分類癌症、診斷癌症及監控預後結果。甚至可發展治療方式，所以miRNA可當作生物性指標。
最近幾年很多學者對miRNA在GBM發生擴展中的作用進行了深入的研究。發表於『OMICS A Journal of Integrative Biology』的一項研究，用次世代定序Next Generation Sequencing (NGS)分析miRNA，發現與正常腦組織相比，在GBM組織中miR-127-3p有顯著性的向下調節(down-regulated)。發現miR-127-3p均可以透過調控其target proteins來影響GBM癌細胞的生長。研究發現，DNA甲基化和組蛋白去乙醯化酶(Histone deacetylases,HDACs)抑制導致miR-127-3p的表現量有向下調節的情況。研究中也通過體內外實驗證實了miR-127-3p使細胞分裂阻滯在G1期，抑制了GBM細胞的生長。最後發現miR-127-3p藉著抑制原癌基因SKI和活化的轉化生長因子transforming growth factor-b (TGF-β)訊號抑制GBM癌細胞生長。 GBM細胞系中miR-127-3p的表現量與細胞的遷移和侵襲能力有著正相關，能調控更多與此相關之基因。研究表明，miR-127-3p在神經膠質母細胞瘤中是一個關鍵因子，也是一個潛在的神經膠質母細胞瘤治療靶點。

Long Non-Coding RNAs為一種不會轉譯成protein的transcripts，長度通常大於200bp，最長可超過10000bp，部分的lncRNA跟mRNA一樣會有alternative splicing，因為和基因的結構相似但不會轉譯成蛋白，早期稱為假基因(pseudogene) ，然而越來越多的研究顯示lncRNA本身參與許多生物調控，如下圖
  
a.     lncRNA HOTAIR,Xist,RepA,Kcnqot1會促使Polycomb complex調控X染色體進行Chromatin remodeling (X異染色質生成，抑制其上面的基因表現)。
b.     以基因cyclin D1基因為例，會受到lncRNA的調控抑制基因表現 (cyclin D1基因表現下降)。
c.      lncRNA Evf2促進DLX2 transcription factor 調節Dlx6基因 (Dlx6基因表現上升)。
d.     DHFR基因的minor promoter產生了lncRNA，並且和DHFR基因的major promoter形成triplex，使得TFIID transcription factor無法binding 到DHFR的major promoter，進而抑制DHFR的基因表現 (DHFR基因表現下降)。
e.     基因Zeb2在genetic locus的antisense上有一個lncRNA Zeb2會導致Splicesome無法與基因Zeb2作用，使得intron retention。

 
上圖來源於(http://sourceforge.net/projects/trinityrnaseq/files/misc/RNASEQ_WORKSHOP/rnaseq_workshop_slides.pdf/download)

過去在進行 miRNA 的研究時，大多是以定序得到的短片段RNA(18~24 bp)去比對 miRBase ( miRNA precursor 或 mature miRNA)，找出miRNA 的種類的表現量，但是這種方法主要的問題在於:

新興感染(emerging infection disease)疾病的病原可能來自於：
尚未偵測到或者未知的病原
已知的病原但散佈到新的地理位置
已知病源經過突變感染更強

NCBI、GenBank等序列資料庫的開放性使許多人的研究如虎添翼，特別是那些早被定過千千萬萬條序列的模式物種，各種基因的序列、註解與表現量資訊皆可信手拈來。反之，以往非模式物種的研究者卻常常必須使用痛苦指數很高的工具如degenerate PCR除草開路，或是在經費限制下使用表現序列標幟(Expressed sequence tag, EST)取得所需的序列資源。
 
但EST library的資訊量依舊有限，雖然能比較部分基因表現量的差異，卻會忽略掉許多表現量較少的基因。現在，你能選擇使用次世代定序儀建造自己的transcriptome sequence database，讓所有有興趣的序列信手拈來。有篇文獻正好說明這麼做的好處。

piRNA 又稱為 piwi-interacting RNA為 small non-conding RNA 的主要類別之一，piRNA 主要具備幾個特性:

目前僅在動物細胞中被發現
目前常見動物的生殖腺細胞中
長度大約是 26~31 nt
5’ 端偏好以 U 做為起始

近幾年來，由於科學家發現 miRNA 與調節基因的表現量有相關，甚至與疾病也有一定的關係存在，所以生物學家慢慢將研究重心趨向 miRNA。Figure1 是從 2001 年到 2010 年與 miRNA 相關研究的資料，由下圖可以看出近年來研究 miRNA 是越來越多了
 
 
因為 miRNA 的表現量與疾病有關，所以可以藉由 miRNA 定量來找出疾病的作用機轉作為新藥物開發之標的。miRNA 定量是藉由 real-time reverse transcription PCR、microarray 與 NGS，而後者 NGS 與前兩者最大不同是在於 NGS 不僅可以找到已知 miRNA 還可以找到未知的 miRNA，則更有利藥物開發，以下 table1 為目前針對 miRNA 所以開發藥物的例子。

RNA-Seq 雖然是這幾年發展的技術，但已經成為分析 transcriptome 的方法，可用來組裝 transcript ，發現 splicing variants 、 single-nucleotide variations 及 fusion genes 等，而 strand specific RNA 更可協助 transcript 組裝及 genome annotation 的正確性。 Lin Wang 等人在 2011 年發表在 PLoS ONE 期刊所發表的研究，提到如何做 strand specific RNA 的 Library construction、與 non-strand specific RNA protocol 比較，及協助證實 gene model 正確性，以下就做個介紹：
Library construction of Strand-Specific RNA-seq
Lin Wang 等人發展的 strand specific RNA-seq 的 Library construction 的方法（如下圖），與 Illumina 原廠所使用的方法差異性不大，只是在第二股 cDNA 合成時，使用 dUTP 取代 dTTP ，並在 Y-shaped Adapter 接上後，利用 uracil-DNA glycosylase （UDG）切除含 dUTP-marked strand。