作者:陳鈺婷/有勁生物科技

 

在定量上,digital PCR (dPCR) real-time PCR (qPCR) 間最大的不同,是digital PCR利用chipdroplet的形式將需要定量的樣品分隔成大量的小分隔,將稀釋的樣品侷限在各分隔中來進行反應,對個別分隔偵測樣品存在與否來決定樣品分子的數量。目前dPCR已被廣泛用於基因序列變異的偵測,如copy number variants或點突變。在分子診斷上,dPCR被應用於癌症學、傳染病學、胎兒基因篩檢及移植排斥反應的預測等。

Rare sequence mutationcopy number數量的偵測為dPCR的優勢;由於dPCR是藉由單一分隔的陰性或陽性訊號來判別,因此不會受限於PCR增幅效應的影響,不需標準曲線來推測分子數目,屬於絕對定量,對於微量樣品的偵測相當有利;但微量定量實驗中,若出現primer設計不良或樣品污染的情形造成false-positive,則會對實驗結果造成極大的誤差。

Rare Variants

若利用dPCR來偵測rare variants,可能發生困難的原因有下面幾個情況:一為dPCR對結果的高度敏銳性並無法避免實驗可能出現的cross-reactivity (fig. 1);用以偵測mutant的引子有可能以較低的增幅偵測到wild type的訊號,若要讓wild typemutant間的差異顯著到能夠被區分,需要調整PCR的條件或重新設計更為適用的引子對。另一個狀況,雖然dPCR有能力從10000wild type序列中找到一個SNP,但也意味著需要50000gene copy數來保證樣品中含有至少一個目標SNP的可能性達到99%,而這樣的樣品濃度在定量上很可能過高,而且在部分案例也很難收集到如此數量的樣本。

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Fig. 1 QX100 droplet digital PCR (Bio-Rad) 上觀察到的cross-reactivity

Bias

大部分以PCR為基礎的定量方法,設計不良的實驗條件很容易造成非專一性放大而高估,但dPCR一般比較不容易過度高估樣品;理論上,除非DNA在分隔前發生denature的現象,造成比實際分子數目多的template分佈,dPCR的檢測結果不容易出現高估的情形;如此情形下也頂多出現原濃度兩倍的高估量。然而肇因於dPCR只會計算有訊號的分隔單位,低估是更可能發生的;當分隔中包含有template,卻沒有被順利放大,這樣的情況稱之為 ”molecular dropout” ;在digital LAMP或定量RNA 樣品時特別容易發生,若templateplasmid supercoid之類難以被複製或DNA受損的情形下,molecular dropout也有可能發生;若樣品中存在有抑制物 (inhibitor) 也會壓低定量結果;為了避免抑制物影響結果的判讀,在定量過程中設置internal positive control就變得很重要。

由於dPCR基礎在於目標的隨機分佈,所以樣品非均質化或template間的連鎖也會造成數量的低估。另一個dPCR的評估基礎在於假設每個分隔的容積都是固定的,且只包含一個template (fig. 2),但這在技術上有相當的難度,只能假設分隔容積造成的誤差在其他操作因素的干預下可忽略;若個別儀器能在每次分析提供相關數據做為品質參數,或許能使定量結果更具有可信度。

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Fig. 2 分隔容積的不一致造成的樣品分佈不一致,導致定量被低估的情形。

參考文獻: J. F. Huggett, S. Cowen, and C. A. Foy. Considerations for digital PCR as an accurate molecular diagnostic tool. Clin. Chem. (2015) 61(1) 79–88.

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