有勁的基因資訊

作者：何胤嫻/有勁基因

　　次世代定序技術中可左右錯誤率的重要步驟，除了能降低定序錯誤率的「定序平台優化」外，還有基因文庫的製備方式；因此一直都有不少科學團隊致力開發更好的文庫製備流程。2021年4月，Nature期刊刊登了一篇英國團隊的研究，內容涵蓋新的研究觀點，還有他們新開發的定序技術—Nanorate Sequencing(NanoSeq)¹。

作者：金漢強/有勁基因

　　次世代定序技術為基因體研究及臨床檢測提供了可靠且價格可負擔的應用，但其在大範圍結構變異的偵測、核酸GC組成的特殊比例區域以及複雜變異區的偵測方面，仍然有所不足；而第三代的定序技術就可以應用在補足上述偵測領域上。第三代定序又被稱為「長讀取定序技術(Long-read sequencing)」，目前平均可以讀取大於10,000個鹼基(10kb)的序列長度。關於第三代定序的基本原理，可參考有勁部落格《第三代定序─ SMRT技術原理》與《第三代定序儀 Oxford Nanopore》的介紹。

作者：葉佳妤/有勁基因

　　DNA甲基化(DNA methylation)是指DNA分子上的甲基化修飾。原核生物的甲基化修飾有助於DNA複製之後對錯誤配對的修補(Mismatch Repair; MMR)；其經常發生在5′-GATC-3′序列中腺嘌呤(adenosine; A)的N⁶分子上，藉由產生A^N6-CH3來區分新舊股DNA，舊股DNA上有A^N6-CH3修飾而新股無，於是內切酶便能正確切除新股上的合成錯誤，進行DNA的修補。此外，若5′-GATC-3′序列上具有A^N6-CH3的甲基化修飾也能輔助原核生物的限制修飾系統(restriction modification system)去抵禦外來噬菌體的入侵。真核生物的甲基化修飾則常發生在胞嘧啶(cytosine; C)的5號C上，將其轉化為5′-甲基胞嘧啶(5′-methylcytosine; ^5mC)。而在哺乳動物身上，DNA序列的某些特定區域，例如啟動子區域(promoter region)、第一外顯子(first exon)等都是常見的CpG雙核苷酸聚集區域(因此又稱之為CpG島；  CpG island)，這些區域上如果發生了甲基化修飾，一般來說，都和基因調控脫不了關係。

作者：林佑軒/有勁基因

　　NGS技術可以偵測血漿中的腫瘤游離DNA(ctDNA; circulating tumor DNA)，讓癌症病患在治療之後，仍能持續追蹤是否有復發的情況；但ctDNA在血漿所有游離DNA(cfDNA; cell free DNA)中的佔比極低，並不容易偵測。目前有一些特殊的文庫建構技術(library construction)─例如分子條碼(molecular barcode)，可以用來輔助NGS偵測血漿中這些比例極低的ctDNA，然而這些技術的要價恐怕並非一般民眾所能承擔，因此很難普及。如果不用特殊的文庫建構技術，改以較低廉的「低覆蓋率全基因定序(sWGS; shallow whole genome sequencing)」技術去定序血漿中的游離DNA呢？但這麼一來，就必須確定病人血漿中是否有出現癌細胞常見釋出的體染色體套數異常 (Somatic copy-number aberration, SCNA) ctDNA，且這些ctDNA在血漿中游離DNA的佔比至少必須超過1成才行；然而這樣的比例，只有在癌症晚期且未經治療的病患才有可能出現。治療後病人ctDNA在血漿中游離DNA的佔比極低，對這些病人來說，低廉價格的檢測方式是偵測不出來的，很難取代那些高價技術的檢測。

作者：劉祥欽/有勁基因

　　PCR(Polymerase Chain Reaction; 聚合酶連鎖反應)可以在生物體外快速擴增微量的特定DNA片段，是一種非常普及的分子生物學實驗技術。PCR擁有高敏感度及高效率的特性，且容易上手、價格低廉，因此廣泛地被應用在生命科學、醫療診斷、法醫鑑識、以及食安與環境檢測等領域。因為「快速」、「擴增」、「微量」的度量形容還蠻抽象的，所以下面就來舉個實際的例子說明。

作者：劉祥欽/有勁生物科技

　　臨床樣品如腫瘤組織等，常常需要被長期保存，因此多會先用福馬林固定後包埋在石蠟塊中(FFPE; Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded)，然後再切片製作成玻片標本。會如此處理是因為FFPE樣本能長時間維持組織的型態，提供病理觀察與診斷之用。然而，福馬林會讓蛋白質與核酸形成鏈結，破壞核酸原本的結構；幸好之後若有經過特殊提取與恢復的處理步驟，仍然能從樣本中取回可用的核酸。

作者：洪郁豪 /有勁生物科技

　　1948 年，Mandel與Métais首次在人體循環血液中發現含有經細胞代謝產生的游離 DNA (cell-free DNA/cfDNA)，其在血漿中所占的含量通常約在1 ng/mL至 10 ng/mL之間。隨後在1977 年，癌症與cfDNA的關聯性研究雖被提出，但相關應用卻是在非侵入性產前檢測領域才有較多重大突破。到了1994年，癌症病人的cfDNA被檢測出腫瘤相關基因的突變型，這些被認為由腫瘤細胞代謝產生的cfDNA突變型，被稱為 ctDNA (circulating tumour DNA)；其中KRAS基因為腫瘤相關基因中最常被提出探討的，在過去腫瘤研究上占有舉足輕重的地位。KRAS基因的功能與細胞分裂增生有關，可藉由開啟或關閉功能來調控細胞生長；突變的KRAS基因會打亂細胞正常生長而引發腫瘤。

作者：劉祥欽 /有勁生物科技

全基因組放大 (Whole genome amplification, WGA) 是進行單顆細胞 (或有限的細胞數) 全基因定序時相當重要的步驟。現行單細胞定序的應用有一大部分是在偵測細胞基因組中染色體套數或是小範圍Mb等級的數量變異 (copy number variant, CNV)。具體而言，​胚胎著床前基因診斷 (preimplantation genetic diagnosis, PGD)、基於胎兒細胞的NIPT、以及循環腫瘤細胞的液態活檢 (liquid biopsy of circulating tumor cells, CTCs) 等都需要以單細胞定序的技術偵測數量變異。由於這些應用的目標細胞取得的難易程度不一，所需的技術也各不相同，因此今天暫且將這部分的問題放在一邊。取得目標細胞後，如何從中得到足量的DNA會是接下來要思考的問題。一般來說，從一顆細胞取得的DNA只會有picogram等級的量，而製作定序用的library則需要nanogram等級的DNA，所以，必須以WGA的方式將DNA均一的放大。

作者：吳上豪/有勁生物科技

對次世代定序來說，定序重複出現的DNA短片段是一項挑戰。由於基因文庫製作時必須打斷DNA，這過程無法控制DNA斷裂的位置，倘若斷裂後的DNA片段未能包含完整重複的序列，就可能影響定序後的基因體組裝。在此與大家分享一篇利用專一性DNA截切技術—CRISPR/Cas9，在基因文庫製作過程中減少重複序列被從中打斷的機會，藉此提高對重複序列定序能力的研究。

作者：劉祥欽/有勁生物科技

血液中會有一些大小在150~200 bp左右，被稱為cell-free DNA (cfDNA) 的小片段游離DNA，它們是來自於細胞凋亡的過程中尚未被完全降解的殘餘DNA。當身體中有癌症組織不斷增長時，部分癌細胞也會因為免疫系統的對抗而凋亡，進而釋放出一些游離的DNA到血液中 (circulating tumor DNA, ctDNA)。組織的癌化常常是因為不斷累積的基因突變所造成的不可逆反應，如果可以辨識出這些可能導致癌化的突變點位，那我們就有機會提早發現癌症與監測治療的效果。

現在，次世代定序 (next generation sequencing, NGS) 為此提供了可能的解方。從大量的cfDNA序列資料中，我們可以從中提取出含有突變點位的序列，但是因為在癌症病程的早期ctDNA所佔的比例通常很低，因此能正確檢測到含量多低的ctDNA會是檢測能否成功的關鍵所在。一般來說，要定出佔2.5%的ctDNA會需要1000倍以上的定序深度。要在特定區域達到這樣的定序深度，可使用hybridization capture或PCR放大的方式來完成。因為有只須少量DNA及實驗流程相對簡單的好處，PCR放大的方法是較被偏好的一種方式。然而在放大過程中，無可避免的會產生一些PCR造成的錯誤 (每個base因為PCR polymerase所造成的錯誤率大約10^-6)，此外，定序時所導入的錯誤率更高，例如Illumina MiSeq系統會有每個base約0.01到0.1的錯誤機率。低佔比加上高錯誤率大幅提高了辨識變異ctDNA的難度。

作者：陳鈺婷/有勁生物科技

在定量上，digital PCR (dPCR) 與real-time PCR (qPCR) 間最大的不同，是digital PCR利用chip或droplet的形式將需要定量的樣品分隔成大量的小分隔，將稀釋的樣品侷限在各分隔中來進行反應，對個別分隔偵測樣品存在與否來決定樣品分子的數量。目前dPCR已被廣泛用於基因序列變異的偵測，如copy number variants或點突變。在分子診斷上，dPCR被應用於癌症學、傳染病學、胎兒基因篩檢及移植排斥反應的預測等。

Rare sequence mutation、copy number數量的偵測為dPCR的優勢；由於dPCR是藉由單一分隔的陰性或陽性訊號來判別，因此不會受限於PCR增幅效應的影響，不需標準曲線來推測分子數目，屬於絕對定量，對於微量樣品的偵測相當有利；但微量定量實驗中，若出現primer設計不良或樣品污染的情形造成false-positive，則會對實驗結果造成極大的誤差。

作者：陳崇斌/有勁生物科技

近幾年定序技術的發展迅速，越來越多人使用次世代定序(NGS)進行基因檢測，試圖找尋個體中基因的變異，藉此來了解未來患病的風險或是患病的原因；如何詮釋基因上的變異，是當今最重要的課題之一；由下圖 (Fig. 1)預估的數值，在NGS的費用上，成長最多的有三項，分別是 Biological interpretation、Data Management與Experimental design；反之，定序所佔的比重下降許多，從百分之30下降到百分之5。簡而言之NGS是未來的趨勢，而Biological interpretation (詮釋)、Data Management與Experimental design又是趨勢中的趨勢，很難忽視其重要性。

Fig 1. NGS 費用所佔比重變化。 Source: Yale University; Frost & Sullivan

     Single Molecule Real-Time (SMRT) sequencing發展至今，的確在讀長方面相當優勢 (約 5K-10Kbp)，但是在定序價格無法降低的情況下，許多狀況並不合適完全取代次世代定序儀，例如：metagenomics 的定序。近年，10X Genomics 導入這套系統甚至可以產生 50 Kb 組裝後序列，但原理細節對外部並沒有公布，而 Illumina 也增加了一種新的 library 製備方式來獲得近似第三代定序儀讀長的結果，商品名稱為 TruSeq synthetic long read (TSLR) technology。這項技術使用過去 BAC library 這常用來研究物種基因體的觀念，將龐大複雜的基因體切割成許多小部份，只不過每一小部份相較於 BAC，insert 增加至 Kb 以上的單位來做次世代定序。

    目前常見的兩種 Long fragment reads library 製備方式，均不需要真的 cloning放入細菌載體中複製，但會將 Kb 為單位的片段打碎後掛上各自的 barcode，再藉由後端解讀barcode，將定序的資料重新分群後以 Kb 為單位組裝，重現近似第三代定序儀讀長的結果。無庸置疑的，在定序未知物種基因體的 de novo assembly 上相當的有幫助，尤其是能跨越重覆序列 (repeat sequence) 來幫助組裝，除此之外，由於多數物種基因體為多倍型染色體，例如：人類是二倍體 (Diploid) 生物，幾百 base-pair 的讀長有時可能無法正確判斷基因座落在何條同源染色體上，如今，這項技術應用在人類染色單倍體分類 (Haplotyping) 研究，甚至能追溯親代基因型的遺傳。

NGS技術中，降低錯誤率一直是很重要的一個環節。尤其是在癌症領域、法醫鑑定、遠古生物的基因體學、cell free DNA應用、metagenomics應用等領域，目標就是要正確地偵測到頻率很低的變異點位。也因此在實驗方法上如果會造成非特異性的錯誤率太高，就會無法正確的將非常稀有的變異點位找出來，這樣的點位會淹沒在非特異錯誤之中。

在2012年，Quail, M. et al. 曾經測試了當時各種定序平台的錯誤率，在當時，illumina 定序平台之隨機錯誤率基準值在0.1~0.5% 之間，而其他定序平台則在>1%。然而經過3年的時間，各家定序平台都推出了新版本的反應試劑，像是Ion Torrent 系統推出了Hi-Q定序試劑，Illumina 系統推出了SBS kit V2。這些定序試劑藉由更改化學配方與反應酵素，嘗試著降低各種可能的錯誤。在2015年，尚未有看到詳盡的新版本評比資訊，但隨著不同廠商不同機種的持續推出，可以期待未來在定序機台本身會有更好的表現。

High fidelity PCR enzyme

在2013年底，Nature Method 期刊將單細胞定序選為年度技術。在發育生物學、腫瘤基因體學、生殖醫學等領域，單細胞定序技術已經開始發揮它的威力，為我們帶來許多珍貴的訊息。本篇主要著重於此技術在當前的現況，介紹目前的單細胞分離技術、放大技術、與一些應用的面向。第一部分將先介紹技術的部份，第二部分將整理一些已發表的應用情形。

單細胞定序的流程，大概可分為1. 單細胞分離，2.依照不同的需求放大樣本進行定序。可以參考圖一。

 圖一 單細胞定序的流程(圖片來源: Single-cell sequencing Vol.11 No.1 | JAN 2014 |Nature Methods)

在Ion torrent 定序平台中，要定序之前，要先做出成功的 emulsion PCR，才有可能有好的定序品質 ， 但首先要克服以下情況:

        1.  Micro-reactor 必須有一致的大小 :

emulsion PCR 是利用油滴包覆Emulsion PCR 必須所含的物質，包含Bead、 一條 DNA template、d NTP、DNA polymerase、co-factor 等等。這樣的一個反應油滴我們稱之為 micro-reactor。一般而言，micro-reactor 的大小約在 20-30 um ， 這樣的大小已經足以提供 Emulsion PCR 一個很好的反應環境。 micro-reactor 若是太大，就會容易造成 polyclonal 的形成 ( 即一個micro-reactor 裡面含有兩條不同的 DNA template，使同一個bead上會有兩種不同序列的 template，造成定序時判讀微弱或混亂 )。

micro-reactor 也不能太小，太小的反應空間雖然可以減少 polyclonal 的形成，卻會使一些emulsion PCR 所需的 co-factor 無法存在於micro-reactor 中，使的Emulsion PCR效率減低。

實驗上，我們時常使用 Polymerase Chain Reaction (PCR) 這項技術增幅目標核酸片段，這在建構NGS gDNA 或cDNA library時亦是其中重要的一環，然而實際上，進行 PCR 會因為兩種現象而機率性地產生非預期的結果：第一、在增幅過程中，片段小的 template 會傾向較容易地被放大；第二、經 PCR產生的產物有部分序列相似時，它們會在 annealing 的步驟中發生部份的雜合配對，而在extension 的步驟被 polymerase 延長，進而產生 chimeric副產物。此外，PCR 的過程中有時會伴隨 primer extension 不完整的產物產生，這樣的產物會在前述的部分配對中，在下一個 PCR cycle 繼續的被延長，但產生大小不一的 chimeric副產物。眾多的 PCR protocol 考量到上述現象，會適當地調整步驟，例如：提高 DNA模板的濃度或是降低 PCR 的 cycle 數，然而，當面對模板 DNA 極微量的情況時，就很難避免 PCR cycle 數的增加，而提高 chimera 出現的風險 (圖一、左)。

針對上述傳統 PCR 的弱點，新式的 PCR 方式被開發出現，利用油水不互溶的特性，製作出許多微小的水滴散布在油類溶液環境中，各種序列不同的模板 DNA 分子被隔離分開至各水滴中，每個水滴均為水性緩衝溶液並包含 PCR 過程所需的材料：DNA polymerase、primer、dNTPs，在適當的比例調配下，每個微小的水滴可少至僅含一條模板DNA 分子，使得每個水滴中的 PCR 反應互相不影響，只會忠實的放大同一條模板分子，所有的 PCR 產物平均地生合成且不會再因部分配對的雜合而被錯誤放大，PCR 反應材料不需競爭、也不因酵素催化的喜好性而出現偏向，徹底解決前述傳統 PCR 的問題 (圖一、右)。

在實驗過程中多多少少會遇到一些問題，例如有兩個分別貼上DNA及RNA標籤的樣品，在實驗過程中標籤都掉了此時該如何分辨？

也許分辨的方法不只一種，但其中一種是可以利用溶液PH值的酸鹼來辨別，首先將兩管樣品分別取出一些加入鹼性溶液中，再去跑膠則就可以判斷出哪一個為RNA。

RNA在鹼性環境下會有不穩定的現象，甚至會產生降解的情況，其原因是RNA 2號碳上的OH基會受到鹼性溶液(OH-)攻擊，而則造成phosphodiester bond 遭破壞而斷裂行成2’，3’-cyclic monophosphate derivative(如下圖)，所以在分子生物中PH值是很重要的介面之一。

在 RNA 樣品製備 NGS 定序上機的前端作業方面，Illumina 所採用的方式是使用 Oligo-dT 來篩選出帶有 PolyA tail 的 mRNA，然而這種方式面對品質較差的 RNA 時，將會受到限制，並且一些不帶有 PolyA tail 的 mRNA，將無法被觀察到，因此有其他廠商使用其它的策略發展新的製備方式，如：NuGEN Ovation，它可以使用少至 500 pg 的 RNA 來完成 library，並且即使 RNA 品質較差，依然可以適用。

圖一、 NuGEN 開發Ribo-SPIA 技術轉成雙股 cDNA

在現今科技進步的社會中，NGS除了扮演尋找SNP與mutation或是de novo sequencing…等等也讓科學家縮短了研究各式各樣基因圖譜的時間。但很遺憾的是目前NGS的前置作業也就是製備library的方法，並沒有可以完完全全代替人力的自動化系統來完成library，因此為了彌補這項缺失Hanyoup Kim,et al.等人開發針對illumina定序平台的自動化library製備系統，此系統稱為microfluidic system，這套系統結合了droplet-based digital microfluidic (DMF)，所以library製備可以在此系統完成。(如下圖)

a. 指microfluidic system，而右上角長條狀的圖示則表是DMF-capillary interface。

b. 左邊圖示原理圖，右邊則是利用microfluidic方法製備DNA library的說明圖。