有勁的基因資訊

作者：尤冠景/有勁基因

單細胞RNA定序(Single cell RNA Sequencing; scRNA-seq)是一種利用高通量定序方法對單一細胞RNA進行擴增與定序的技術，可以幫助微觀、了解和鑑別不同類型的細胞及其基因的表現。單細胞RNA定序的原理是在微流體裝置設置三個通道(如圖一所示)，利用流體技術讓細胞先與裂解緩衝液(Lysis buffer)中鑲嵌著DNA primer的微粒(microparticle)會合；當流經含油的通道時，細胞會被油滴一個個隔開，以一個細胞搭配一個微粒的組合形成各自獨立的微滴(droplet)；隨後微滴內的細胞迅速被裂解緩衝液分解(cell lysis)並釋出mRNA。微粒上所鑲嵌的DNA primer各自標誌了不同的標籤序列(barcode)以及可用來抓取mRNA的Oligo(dT)序列；當微粒抓取完mRNA後就會打破微滴，進行反轉錄與模版交換，然後進入PCR程序。RNA擴增完成之後，每個細胞的RNA library都會包含不同的標籤序列，定序分析時便可透過這些標籤序列去區分每個細胞的RNA表現狀況。詳細過程如圖一所示¹。

作者：張益祥/有勁基因

      我們在做微生物菌相分析時，經常接觸到兩個名詞⼀微生物相(microbiota)和總體基因體(metagenome)，這兩個詞彙時常被大家搞混導致誤用，所以作者很貼心的用以下圖文來解說給大家，如圖一。

作者：鄭翰欽/有勁基因

　　 牛津奈米孔技術 (Oxford Nanopore Technologies；以下簡稱ONT)，為史上第一個利用「不同時間點的電流值變化」來偵測序列內容的定序技術(其原理可參考有勁部落格《第三代定序儀Oxford Nanopore》)。由於ONT產品在2017年之前的定序錯誤率較高(accuracy≦90%)，當時筆者對此項技術的感想為：有潛力但還不具實用性。然而近日聽取ONT台灣代理商蘇秉堉博士對ONT定序品質、特性與應用的介紹後，從此對Oxford Nanopore技術的印象大為改觀，也對ONT產品的應用多了幾分期待。以下先為大家針對ONT的定序品質與特性做個簡介。

作者：吳上豪/有勁基因

        有勁基因實驗室獲TAF的認證，實驗操作有一定的品質保證；但客戶的樣品五花八門，實驗過程中難保不會出現異常的狀況。筆者在這裡透過前陣子收到的一個阿拉伯芥RNA定序案件，想和大家分享該案件從樣品最初的品質檢測到後續文庫製備的過程中一些相當值得討論的資訊。

作者：林志鵬/有勁生物科技

    自2008年開始，次世代定序技術便一直推陳出新，定序價格因此不斷往下探底；例如2017年Illumina推出的NovaSeq，目標就是要讓人類全基因體定序價格下降至100美元。而定序價格的下降也讓許多國家開始想藉由全國性大規模定序計畫 (例如1,000 Genome Project、UK10K、Taiwan BioBank等)來確認其人民的基因是否具有地域性或種族特殊性，並了解該國種族基因有哪些染色體變異屬於常見變異，哪些屬於罕見變異。一般來說，與疾病相關的染色體變異幾乎皆為罕見型，畢竟整個人類群體裡帶有疾病基因的屬少數。然而我們不能反向解讀這樣的關係，亦即，罕見的染色體變異並非皆與致病有關。因此該如何解釋這些意義不明且罕見的變異，並能進一步區分該變異是否為良性或與致病相關，就變成大家亟希克服的難題。

作者：金漢強/有勁生物科技

從去年年底BBC記者報導中國「天網」監控系統測試的新聞¹開始，有關「監控」的報導三不五時就會出現；大數據監控的影響力顯然無遠弗屆。關於監控，以人權論，台灣或許真的較進步；不過從累積大數據的角度來說，中國無疑地正以不可思議的速度在成長，這當中也包括了基因數據的積累。儘管有報導指出中國的數據採集過程有各種爭議，但是數據庫的快速增長也是不爭的事實²。

作者：黃勤方/有勁生物科技

「我的名字叫江戶川柯南，原本是個名偵探，不幸被歹徒灌下毒藥而變小。身體雖然縮小了，頭腦還是一樣的好。無論如何，真相只有一個！」如果你和筆者一樣是個七年級生或者剛好跟筆者一樣熱愛推理、蒐查破案等劇情片的迷妹迷弟們，相信這段經典對白一定不陌生。如果你對以上不感興趣也沒關係，面對性侵、離奇兇殺案與無名屍等等社會新聞，一定會問「兇手到底是誰?」「這個人是誰?」。事件會隨人們日常柴米油鹽而逐漸淡忘，但法醫和科學家們仍鑽研一個合適的科學方法去揭露真相。

作者：金漢強/有勁生物科技

HLA (human leukocyte antigen)是坐落在人類第六號染色體上6p21.31的一連串基因座。於其上可以說是人類基因體中多樣性最大的一個區域，許多的免疫相關基因坐落在此區域中。  其中大致可分類為：

第一型人類白血球抗原：

作者：李覺白/有勁生物科技

Circular RNAs是一種環型的non-coding RNA,雖然早在1970年就被發現，但在近5年才因為NGS的技術，讓科學家能夠更深入的一探究竟。一般我們熟知的基因，是轉錄後經Splicing形成的線性RNA(linear RNAs),而circRNAs則是形成環狀的封閉結構。

作者：金漢強/有勁生物科技

在表觀基因體學中，Histones與其上攜帶的修飾是否可以被帶到下一代中一直是核心的爭論議題。不像是DNA或是其他核酸樣板的修飾，Histones修飾的遺傳性一直都還未能解決。主要原因在於Histones到底是如何的在核酸複製時產生之replication fork中同步遺傳仍然是未解之謎。

不過有越來越多的證據顯示在Histones上的標記應該是可以進行遺傳的。在2015年的兩篇Science發表的報告顯示了H3K9甲基化是可以遺傳到好幾個細胞世代。Moazed與Allshire的團隊分別發現了這個現象，如下圖一，在Clr4 H3K9 methyltransferase作用下，H3K9me可以在不同世代的酵母菌(Schizosaccharomyces pombe )中產生遺傳作用，而且是在沒有cis-acting transcription factors或是相關DNA sequence情形下產生。重要的是，需要抑制住Epe1(一個推定的 demethylase)之作用。在Strome等人也發現類似的現象。他們在C. elegans上發現與Polycomb repressive complex 2(PRC2)有關的H3K27甲基化在沒有PRC2的時候也能夠表現在子代。雖然有這些證據，但是詳細的分子機轉仍然有待研究。有部分可能可由PRC2之結構有關。

圖一: circRNA的生成及功能(圖來源: Wilusz, J. E., and Sharp, P. A. (2013). Molecular biology. A circuitous route to noncoding RNA. Science 340, 440–441. doi: 10.1126/science.1238522 )

Circular RNAs (circRNAs) 是一種環型的noncoding RNA (ncRNA)，早在1991年就有研究發現此類型的 ncRNA，但將近20多年來，人們對於circRNAs的了解依舊陌生，近兩年多篇研究使用NGS RNA-Seq的定序的技術，於哺乳動物細胞中找到大量的novel circRNAs，其研究成果也登上知名的期刊nature及science。

    定序技術不斷推陳出新，自諾貝爾化學獎得主Frederick Sanger起，迄今核酸定序之成本、時間與技術，也逐年的縮短與降低。本篇主要介紹半導體對於定序的應用，其中喬納森•羅斯伯格（Jonathan M. Rothberg）扮演著舉足輕重的角色，他是位專精於生物領域的發明兼企業家(圖一)，同時也是454生命科學公司（454 Life Sciences）的創業者，成功研發焦磷酸測序技術（pyrosequencing），就在羅氏公司（Roche）併購了454生命科學公司的同年，他創立Ion Torrent公司，羅斯伯格本身亦是蘋果公司創辦人賈柏斯 (Steve Jobs) 的推崇者，因而從IT （Information technology）角度捕捉靈感，進一步將半導體微晶片的概念，跨領域的導入定序技術中，不僅在基因定序領域中具有開創新穎性，其所創造的生技經濟效益，更被富比士財富雜誌評選為封面人物(圖二)。

(圖一)

火星一直被許多人討論可能會在數十億年前有生命體的存在，甚至上火星的探勘器有發現疑似是水的流路或冰河痕跡，所以更有科學家大膽推測地球上的生命是源自火星。當然這些討論及假設目前並沒有確切證據可以證實，但回歸到地球生命的本質，DNA及RNA架構了生命體，所以找尋火星上是否有DNA或RNA的存在，並且進一步定序，可提供科學家許多的資訊來找尋生命的蹤跡及推斷生命的起源。若直接由火星採集樣品再回地球執行定序，在時間上會非常耗時(來回火星及地球就要耗費數年)，除此之外，DNA及RNA也有可能在運送過程中降解，所以研究人員希望能夠直接在火星上執行定序，稱之為in situ Life Detection，如此可立刻知道定序的結果，若有問題亦能立即再採樣。

        麻省理工學院Christopher E. Carr研究團隊提出使用次世代定序系統執行in situ Life Detection任務的概念，並且認為相對較為單純的無光學系統半導體定序技術是較為適合的平台，然而在外太空輻射線充斥的環境下，可能會對於定序過程有所影響，因此，他們將Ion torrent的314 chip處理各式各樣強度及種類不一的輻射(Fe-56, O-18, H-1)，並進一步分析其產生的影響，實驗設計如下表所示，總共40片的chip，其中20片用電子的方式測試輻射照射前及後的影響，另外20片經輻射照射後，直接拿來定序E. coli的DNA，並且分析定序結果。

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相信許多人都看過侏儸紀公園這部電影，藉由DNA的解序有機會可以重現已滅絕的生物，然而，現階段的生物技術實現侏儸紀公園的場景，還有一大段路要走，主要原因便是DNA品質問題，化石內的DNA遭受了千百年，甚至上百萬年的氧化、水解等化學反應，DNA的化學結構已經有明顯的改變，不但，破碎且含量非常微少，這篇文章主要是要來探討古老DNA定序所面對的問題。下述三個類型的化學反應是在化石中常見的。

1. Hydorlysis

這會發生在DNA磷酸與Purine的位置。

非洲裸鼠 (Naked mole rat) 學名：Heterocephalus glaber 是一群在東非地底底棲生活，大小約 8-10 cm，重約 30-35 g 的鼠輩，牠們擁有一般地底生物常見特性，例如：耐熱、耐 CO₂、視力不佳、能敏銳感受震動，牠們進行鼠類中少見的團體生活，並且具有哺乳類動物中唯二的真社會化系統 (Eusociality)，只有女王鼠能與少部份雄鼠繁衍後代。

不僅如此，這群生物還擁有許多神祕且迷人的特性，雖然身為哺乳類卻是冷血動物，能耐餓耐渴，還不怕毒、不怕酸、不怕痛，擁有易於攜氧的血球系統，因此牠們適應惡劣逆境的能力極強。單若光是以上的特性也許尚不足以吸引科學家的目光，特別的是這群鼠輩能活 30 年之久，聽起來普通卻是一般鼠類的 3 倍，在牠們走向生命盡頭的前一刻，身體內的器官不會衰竭，也不容易出現腫瘤造成癌症，而且一直到老都仍保有生育能力，如此強大物種的基因庫，成為科學家們醉心研究的目標。

    2011 年發表在 PLoS ONE 上的期刊，使用Roche 454 以及 Illumina GAIIx 次世代定序系統，在沒有 reference genome 下進行非洲裸鼠 transcriptome 定序，並使用 CLC bio 進行 454 reads 的 RNA de novo 重組，並且將 GAIIx 獲得的 reads Mapping 回小鼠基因體進行比對分析。下表是將非洲裸鼠基因與野鼠基因比較後，超過五倍以上表現量的基因列出，從表中可得知在非洲裸鼠中，與 mitochondria 、乙醯化、氧化還原等相關基因被大量表現，並在 KEGG pathway database 中找到與脂肪酸代謝相關的基因被大量表現。

真核生物rRNA包含28S、18S、5.8S、5S四種rRNA，一般在判斷RNA是否有降解時，會去觀察28S與18S rRNA的狀況，在RNA品質佳的狀態下，28S rRNA總量應為18S rRNA的兩倍左右，如下圖分別為哺乳動物的RNA proflie，

NGS 的高輸出量特性，帶給基因體學研究上的突破，然而，目前技術仍有存在一些缺陷，其中最令人詬病的點是定序深度不均勻，造成 NGS 必須提升定序深度，來彌補定序深度不均勻的問題。造成定序深度不均勻的原因很多，其中最明顯的就是序列 AT 或 GC bias 造成，往往 high AT 或 high GC 的區域很難得到滿意的定序品質與定序深度；有一部分的原因很可能是 library 製備過程中造成的，一般 NGS DNA library 製備流程包含，fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation、PCR 等步驟，製備流程中，所有的環節都有可能會造成bias，當然包含每一個純化的步驟。為了釐清到底是哪一步驟造成，Aird 團隊利用 QPCR 來檢驗 library 製備流程產生 bias 的情況 (Aird et al. , 2011)，結果整理於圖一，縱軸是序列的數量，橫軸是 GC content 的百分比。由圖一可以清楚地觀察到，library 製備的流程中，PCR 過程是造成 bias 的主要原因 (圖一)；而 fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation 等步驟，不太會產生 high AT 或 high GC 的區域定序深度下降的問題。

圖一

要讓定序深度更加平均，從 PCR 步驟進行改良將是最有效率的。當然製作 PCR free 的 library 一定是最有用的方式，除此之外，還有三種方式來改善 PCR 造成的問題:

融合基因 (fusion gene) 經常發現在血癌、前列腺癌及軟組織肉瘤中，並且有越來越多證據顯示與導致該癌症的發生有關係。融合基因的形成是由於染色體發生了易位 (translocation) 、刪除 (interstitial deletion) 或倒置 (inversion) 所造成，融合基因所表現的融合蛋白 (fusion protein) 在功能上會有所變異，以慢性骨隨白血病 (Chronic myelogenous leukemia) 中 BCR-ABL  融合基因為例，BCR-ABL 會表現成 tyrosine kinase 並活化細胞周期調節系統中的控制週期蛋白，加速細胞分裂，並抑制 DNA 修復，導致病變，並且在 95% 的患有慢性骨隨白血病的病人中皆有 BCR-ABL 基因，因此可當成 biomarker 來判別是否罹患慢性骨隨白血病。

 應用 NGS 的技術在 RNA-seq 上，陸續有研究在癌症發現新的融合基因，Michael F. Berger 等人在2010年使用 GA2 定序了 10 個皮膚癌樣本的 RNA-seq，從中首次發現了融合基因，對於皮膚癌在生物調控上的機制給予新的觀點及突破。