自從 NGS 技術發展至今,已有無數的古老生物被進行定序,這些生物樣品可能來自數千年以前。為了進行定序,首先需要將這些受損或降解的 DNA 片段製備成可供 NGS 定序儀上機使用的 library,而製備的目的主要是讓 DNA 片段兩端接上人工合成的 adapter,一則可起始定序反應,一則可用作 PCR 增輻反應。目前製備的主流方式分為兩種:一種是 454 Life science 使用的 blund end ligation;另一種是 Illumina 使用 Y 型結構的 adapter 進行 A-T ligating,不論何種方式,均為雙股 DNA 的黏合反應,然而,在操作古老 DNA 時,這種製備流程可能會發生一些缺憾。
使用新的單股 DNA 來製備 NGS library,比較目前常見的方式具有以下的優點:
第一、製備過程中 DNA 標示上 biotin,因此純化的步驟使用 streptavidin-coated的磁珠,能減少樣品流失。
第二、當 DNA 品質很差,在環境壓力或溫度破壞下出現單股 DNA 的形式時,只有使用單股 DNA 的製備流程能夠保留它並且成功製備成 library。
第三、雖然原理不相同,但使用單股 DNA 的製備流程仍然具有避免產生 adapter dimer 的機制以避免影響定序品質。
單股 DNA 進行 NGS library 的製備過程簡述如下 (圖一):
1. 使用 phosphatase 去除磷酸根避免樣品 self ligation,及移除 deoxyluracil。
2. 加熱使 DNA 變成單股,隨後黏上一段單股 3’端帶有 biotin 的 adapter。
3. 使用 streptavidin beads 固定 biotin-DNA,加入一段 5’tailed 的 primer 與 adapter 雜合。
4. 使用 DNA polymerase I 補齊互補股,再使用雙股的 adapter 進行游離端的blund end ligation。
5. 上一步驟的 adapter 經過設計只有單股可以黏上 DNA fragment,因此在進行下一步驟的熱處理時,只有 DNA polymerase I 複製出的互補股會包含兩端的 adapter。
6. 進行互補股的 PCR 增幅,同時利用 primer 將增輻片段加上 index 序列。
藉由上述單股 DNA 製備 NGS library的流程,即使 DNA 受到損壞變成單股,也能在製備 library 的過程中被保留並且上機定序,因此可望能在研究古生物 DNA 的基因體中獲得更完整序列。然而,考量到成本以及操作時間,因此,一般的 DNA library 還是適合使用官方雙股 DNA 的製備流程,在何種情況下使用不同的製備流程,就要由研究者來決定了。
圖一、
參考文獻:
Gansauge, M.-T., Meyer, M. Single-stranded DNA library preparation for the sequencing of ancient or damaged DNA. Nature protoc. Vol. 8 NO.4 737-748 (2013).
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