有勁的基因資訊

在先前我們已經介紹使用於window7下使用bowtie(http://yourgene.pixnet.net/blog/post/92081187)，今天在來介紹在window7下使用bowtie2的流程，bowtie2跟bowtie的最大差別在於bowtie2將reads比對到參考序列上時能允許indel的容錯率。

步驟一: 下載bowtie2

首先請先下載bowtie2 (64位元版本，32位元版本)

步驟二: 解壓縮及放到C槽下

並解壓縮到C:\下

步驟三: 使用命令提示員操作執行指令

bowtie2在操作方面與bowtie一樣需使用執行指令的方式來執行，在window7下則需開啟命令提示字元，快速開啟的方法是 1. 【開始】→2. 輸入cmd →3. Enter，之後請輸入cd c:\bowtie2-2.1.0，則命令提示字元的畫面會切換到前一步驟解壓縮的位置。

步驟四 :執行bowtie2，以paired-end read做alignment

在bowtie2的資料夾下，已經有將Enterobacteria phage lambda已知的基因體序列做完索引放在C:\bowtie2-2.1.0\example\index之下; 測試用的reads放在C:\bowtie2-2.1.0\example\reads下

最簡單的指令請輸入bowtie2-align -x example\index\lambda_virus -1 example\reads\reads_1.fq -2 example\reads\reads_2.fq  -S lambda.sam

 當輸入完上列指令後，螢幕會列出此alignment步驟的結果，共用10000個paired-end reads，其中有9166個paired-end reads是有unique的map到lambda上，42個paired-end reads是discordantly的map到lambda上，另有579條 single-end reads (broken reads) map到lambda上; 整體的alignment rate為94.97%

而打開資料夾可看到lambda.sam這個檔案

sam檔中紀錄了reads map到lambda的資訊，詳細資訊可參考(http://samtools.sourceforge.net/SAM1.pdf)

步驟五: 準備Import至IGV的檔案格式 (前置作業)

這個步驟需要使用到samtools，請先下載samtools ，並解壓縮至C槽。

於命令提示元輸入cd c:\samtools-0.1.12a_i386-win32

並依序完成下列3個指令

(1) samtools.exe view -bS c:\bowtie2-2.1.0\lambda.sam -o lambda.bam

(2) samtools sort lambda.bam lambda_sort

(3) samtools index lambda_sort.bam

完成後打開資料夾可看到有三個檔案產生

除了alignment的檔案之外，我們還需要lambda genome的註解資訊，請先到(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/9626243)下載lambda genome的genbank 格式另存到C:\samtools-0.1.12a_i386-win32下。

接著連到(http://www.ebi.ac.uk/Tools/sfc/readseq/)， 並將lambda genome的genbank檔案上傳，並將INPUT FORMAT改成GenBank，OUTPUT FORMAT改成GFF並submit。

執行完的結果如下圖，請將檔案另存新檔為NC_001416.1.gff到C:\samtools-0.1.12a_i386-win32下

NC_001416.1.gff檔案打開內容如下

請將NC_001416取代成gi|9626243|ref|NC_001416.1|，並將第三行的” NC_001416 -     source     1      48502…”移除，修改並存檔，結果如下

此時C:\samtools-0.1.12a_i386-win32的目錄有以下這些檔案

步驟六: 使用IGV來瀏覽reads map到lambda genome的情形

IGV的細節可參考(http://yourgene.pixnet.net/blog/post/96403107)，使用上需先安裝JAVA (java載點) 及IGV (IGV載點)。

請先將IGV解壓縮到C槽下，並滑鼠點擊igv.jar開啟igv

開啟後的初始畫面如下

Import genome sequence (Genomes->Load Genome from File->選取C:\bowtie2-2.1.0\example\reference\lambda_virus.fa)

Import alignment file and annotation file (File-> Load from File-> C:\samtools-0.1.12a_i386-win32\ lambda_sort.bam及NC_001416.1.gff)

將alignment檔案及註解資訊輸入至IGV後的畫面如下 

接者來看這次reads map到lambda genome的情形
例如在43,615-43,717的NinI基因上出現了一個SNV
reference的base為A，reads上出現的為C

接者看第二個例子，在6,712-6,814的E基因上，則有一個deletion

在這邊我們以bowtie2提供的範例檔來練習alignment, 轉換格式及IGV的使用，同樣的流程也可應用在有已知基因體序列的物種上。

如果需針對特定參考序列做alignment，需使用bowtie2-build這個指令來建立index，語法是bowtie2-build <input.fasta> <index檔名> 

bowtie2的首頁也已提供了一些常用物種的基因體序列index檔

請連至(http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml)