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隨著定序價格的降低，以及Illumina定序長度的增加，越來越多人改用Illumina HiSeq或MiSeq平台進行16S metagenomics sequencing。定序所需之library製備方式，也不斷地在改進。以下列出幾種常見的幾種16S metagenomics sequencing之library製備方式，以及各自的優點與缺點。

採用 Barcoded 16S rRNA primer & Illumina TruSeq DNA Library Preparation

首先我們須先根據待定序的樣品數目, 設計不同的 16S-barcoded-primer。以16S的V1-V2 region為例，在27F以及338R primer 的5’端加上6-mer的barcod序列 (如下表，粗體底線的部分是barcode序列，其餘則是原本的16S primer序列)。

使用上述primer 序列放大樣品中的16S region之後，再將各樣品等量混和成一管，並根據Illumina TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation製備library，流程圖如下：

此方法之優點為：將多個樣品pool成一管，製備一個library，可減少library製備之成本；缺點為：由於將多個樣品混和在一起，容易在後續PCR amplify的過程中產生Chimera reads，可選用 PCR-Free之library製備方式，以避免Chimera reads的產生。

採用 Single-indexing 16S rRNA targeting Library Preparation

Caporaso等人在2011年提出的方法，我們可以設計長片段之PCR primer，包含Illumina adapter、index以及16S primer，再利用此 long overhang PCR primer去放大樣品中的16S rRNA 區域，如下圖所示：

此方法設計的長片段 primer中，除了16S region的primer以及Illumina adapter之外，還另外加上了”Pad”和”Linker”的序列，這兩段序列是為了避免長片段之primer容易形成dimer而添加的。此優點之方法為：相較於使用Ligation添加Illumina adapter，使用PCR的方式，library製備的效率較好，且PCR完後就可以直接上機定序，減少library製備的中間步驟；缺點為：此方法之每一樣品均需要設計不同的primer set，primer合成價格較高，另外長片段primer PCR，也容易造成primer-dimer、hairpins、專一性降低等問題。

採用2-step PCR & duel-indexing 16S rRNA targeting Library Preparation

此方法為Illumina官方網站上面目前提供的16S rRNA library preparation protocol。相較於Single-indexing 16SrRNA library preparation，只有在3’端的adapter上放置index，Duel-indexing 在5’端以及3’端的adapter都有放置index。另外使用兩階段的PCR，第一組PCR primer包含部分Illumina adapter序列以及16S primer序列，第二組PCR primer則包含完整的Illumina adapter序列以及index部分。詳細圖示如下：

此方法之優點為：使用PCR方式加上Illumina adapter序列，library製備之效率較高，且使用二階段PCR，第一組PCR primer所有的sample pool都可以共用，且可以避免長片段primer在PCR過程中的專一性問題。缺點則為：雖然第一組primer可以共用，但第二組primer(含index)仍然需要每個樣品各自設計，故primer設計成本以及library validation的價格較第一種方法高。

上述三種16S rRNA library製備方式，研究者可以根據自己的需求，成本考量，而選擇不同的製備方式，目前這三種方式都可以找到許多paper採用，其中第二種方式，是目前Earth microbiome project上所提供的16S rRNA Amplification Protocol，且每個protocol中的16S primer，也可根據研究者想要看的不同區間來做替換，增加實驗的彈性。

參考文獻：

1. Lazarevic, Vladimir, et al. “Metagenomic study of the oral microbiota by Illumina high-throughput sequencing” J Microbiol Methods (2009) 79(3): 266–271.
2. Caporaso, J. Gregory, et al. “Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample” PNAS (2011) 108(Suppl 1): 4516–4522.
3. Caporaso, J. Gregory, et al. “Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms” ISME J. (2012) 6(8): 1621–1624.
4. Illumina: 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation.