有勁的基因資訊

作者：洪郁豪/有勁生物科技

精準總體基因體學 (Precision Metagenomics)─利用總體基因學分析，快速診斷傳染性疾病並監控公共衛生

傳染病威脅著全球人口的健康，尤其會對抵抗力低下的醫院病患造成危害，因此，迅速確診病原是相當重要的工作。目前作為病原診斷的常用手段包括分離培養、目標基因片段增幅（targeted PCR）、微矩陣（microarray）鑑定及血清學分析等技術，花費的時間頗長，常需要數天至數週。此外，這些方法很難判斷傳染病為單一病原感染或是多病原共同感染所引起；在面對尚無法培養或完全寄生型病原微生物時更是棘手。不僅如此，選擇治療方法時，若無法確知病原的致病力，還容易造成抗生素的誤用或浪費，甚至產生抗藥性病菌。因此，利用最新生物技術改良過去傳染病病原的診斷方法，提高精確性的同時也縮短診斷的流程及時間，便是診斷技術很重要的改進方向。

次世代定序技術自過去十年發展以來，除了幫助學術上的研究，也漸漸被應用在臨床疾病的診斷上，例如總體基因體學（Metagenomics）就是；若能進一步將其在微生物與基因分佈上的學術研究成果，應用在人體疾病的診斷治療上，提供即時、高解析度、菌株分型（strain typing）的資訊，便能縮短診病時間、提高治療效率，並達到節省開銷、延長病患壽命的優點。康乃爾大學威爾醫學院生理與生物物理學系的研究學者們，就以精準總體基因體學為基礎，提出了三種病原樣本篩檢管道的構想：（1）STAT Track、（2）Comprehensive Track、（3）Targeted Track（見附圖一）。

首先，無論何種管道，第一線醫護人員從病患身上一取得樣本，就必須立刻送往實驗室進行核酸（DNA、RNA）萃取。第一種STAT Track流程（詳見附圖一的綠色線條流程）建議在對病況緊急的病患時採用。為了在24小時內盡快獲得結果，這個流程於試劑輔助下，排除人類gDNA汙染、提高微生物相DNA濃度，並在耗時少於10分鐘的library建構過程之後，使用諸如Nanopore第三代單核酸分子定序技術（見附圖二），於最短時間內取得基因序列資訊，再利用標準化後的生資分析流程，便能獲得微生物的DNA資訊及毒力因子。

當面對病況較不緊急的病患時，可以從另外兩條管道著手。其中Comprehensive Track（詳見附圖一的橘色線條流程）在病人樣本萃取DNA與RNA後，利用次世代定序系統中定序量更深的Illumina Miseq平臺來進行作業，相較於STAT Track，更能全面性發掘更多種已知或未知的致病微生物，連RNA病毒，也能額外得知微生物RNA表現及抗藥性基因等方面的資訊。

Targeted Track（詳見附圖一的紅色線條流程）主要是採用核酸片段增幅技術（PCR），利用多種primer獲得包括真菌28s rRNA、細菌16s rRNA、已知的RNA病毒等資訊，並能綜合以上取得的結果，將微生物的種類細分至種、亞種、分離株（strain）以下的程度，再藉由後端更詳盡的生物資訊分析，以微生物的代謝路徑及基因表現來解釋病原微生物的病理、生理與生物物理機制，因而找到病患病狀與感染的原因。此整個過程雖然需要花5至7天的時間，但與傳統方法所費時間相比，仍在合理範圍內。

圖一、精準總體基因體學應用流程圖 

圖片來源：Afshinnekoo E, Chou C, Alexander N, Ahsanuddin S, Schuetz AN, Mason CE. Precision Metagenomics: Rapid Metagenomic Analyses for Infectious Disease Diagnostics and Public Health Surveillance. J Biomol Tech. 2017 Apr; 28(1): 40–45.

圖二、Oxfold Nanopore 定序技術流程圖

圖片來源：Nanoporetech

那麼，目前若想實現以上構想，還需面臨哪些挑戰呢？首先是病人樣本採集方面，來自各種不同罹病組織的樣本，必須在避免被汙染及產生潛在鑑別偏差的情況下，盡量完整萃取並收集所有種類的核酸；然而在面對大量人類核酸也同時存在的情況下，必須能夠找出合適策略排除這些污染源的干擾才行。

圖一的三條病原樣本篩檢管道，不論哪一種，最後都會進入後端的生物資訊分析流程。在生物資訊分析的階段，為確保分類的精確性，使用2至3種以上的分析軟體是必要的，如：k-mer、marker、以 alignment 為基礎的程式。另外也要重視使用未經特殊處理的群體微生物相空白試驗背景值（positive control mock communities）作為正控制組，才能篩掉不需要被納入關注的假陽性（false positive）物種。如果不只要鑑定菌株，而還想知道這些菌株能做什麼，例如：提出代謝途徑、抗藥性基因、毒力因子等資訊，則資料庫的選擇就非常重要，而日以益進地擴充建構微生物的參考序列（reference genome），且不間斷地補充新知才有可能達到以上目標。

雖然目前仍有一些困難需要突破，但可預見「基因定序」這項技術在不久的未來將扮演「分子顯微鏡」的角色，於疾病診斷、傳染病及公共衛生改善上的實際應用，將會越來越成熟進步。

參考文獻

1. 1. Afshinnekoo E, Chou C, Alexander N, Ahsanuddin S, Schuetz AN, Mason CE. Precision Metagenomics: Rapid Metagenomic Analyses for Infectious Disease Diagnostics and Public Health Surveillance. J Biomol Tech. 2017 Apr; 28(1): 40–45.
2. 2. DNA extraction and library preparation for rapid genus- and species-level identification, with or without PCR (https://nanoporetech.com/publications/dna-extraction-and-library-preparation-rapid-genus-and-species-level-identification-or)