有勁的基因資訊

作者：洪郁豪/有勁基因

　　臨床上，癌症精準醫學可透過所謂的「液態活檢」來進行診斷；此方法是利用偵測血液中的「生物標記」來達到癌症預測和預防的目標。近年的研究常採用取自癌症患者液態活組織內的血液標記—血液循環腫瘤DNA(ctDNA)做為觀察對象。腫瘤細胞在患者體內會通過不同的機制將ctDNA釋放至血液中，而帶有腫瘤細胞基因組成訊息的ctDNA因此便是很好的研究目標。監測血液中的 ctDNA可得知腫瘤動態並可預測或評估藥物反應；但是ctDNA 游離在血漿中時經常會斷裂成短片段，混合在游離DNA(cfDNA)裡成為其中一部分，比例通常相當低，所以臨床上要將腫瘤ctDNA當作突變標記進行篩驗，十分具有挑戰性。面對這樣的檢體，本篇想簡短的分享一下作者本身收集血液中游離 DNA檢體時曾遇過的現象，提供大家作為參考。¹

　　在此之前，我們先來了解一下ctDNA的分子特性。一般來說，ctDNA被動釋放到血液中循環有兩種起因，一是由於細胞的「自然凋亡(apoptosis)」、其二是細胞「受到外因作用而壞死 (necrosis)」。死亡的細胞經過酶切， DNA 裂解之後的片段仍會纏繞在單核小體(nucleosomes)周圍，長度約為 166 bp。長度在320 bp到 1000 bp之間的DNA片段，則常是體內免疫系統的防衛細胞將壞死細胞吞噬分解後釋放到血液中而來的。此外，ctDNA也會主動從癌細胞外囊泡分泌釋出，此時的長度則約在 150 bp到250 bp 之間。

　　血漿中「從腫瘤而來的ctDNA」在「游離 DNA(cfDNA)」的佔比，通常從百分之 0.01到百分之九十都有；而 cfDNA的濃度在一般健康個體的血漿中，每毫升約含有0至100 ng，平均濃度大約為30 ng / mL¹。然而從過往處理癌症患者檢體的經驗¹中發現，cfDNA濃度有時會出現升高10倍，達 1000 ng / mL以上的情況。

　　檢驗樣本從採血至離心過程中的延遲時間，會大大影響最後所測到的cfDNA 濃度。即使採用了含有防腐劑，能防止紅血球、白細胞因溶解而影響到 cfDNA 品質的專用採血管，在全血狀態下也只能儲存於室溫數天，且仍舊有可能出現細胞溶血現象，造成 cfDNA 品質下降而影響了後續的檢測靈敏度。

　　下圖一A為本公司實驗室收樣後，因檢測到濃度異常升高情況，而採用自動電泳系統進行品管監測的結果。圖中可看到出現頗多分子量偏大的「gDNA汙染現象(genomic DNA contamination)」；一般品質且濃度正常的 cfDNA (見圖一B)，其縱軸的觀察訊號應該會出現在 150-250 bp 左右的位置。如前面所提：健康人每 1 毫升血漿中約含 0至100 ng的 cfDNA，若是血漿被分子量偏大的 gDNA 汙染，篩驗樣品時所測得的cfDNA濃度同樣也會出現異常升高的情況，因此在處理癌症病患的 cfDNA 樣品時，光是看濃度有無異常升高，並不能作為癌症篩驗判讀的絕對依據。前面有提到：癌症患者的cfDNA濃度可能會高達 1000 ng / mL ，和一般人相較相差十倍以上； 「cfDNA濃度出現大量提升」這種現象，才是起因於來自癌細胞的 ctDNA。因此，為釐清樣品濃度升高的原因，就必須採用自動電泳系統來加以確認。圖一C中可見，觀察訊號增強了十倍以上，且訊號是固定在 150-250 bp 左右的位置，由此可判斷訊號的增強是源於ctDNA濃度的升高。倘若對圖三的波形仍有疑問，可以將樣品稀釋約十倍，再看看是否有出現像圖一B的波形；如果有，那就可以確定是ctDNA濃度升高造成的結果。

　　以上經驗分享，大家想利用取自癌症病患的游離 DNA(ctDNA) 做檢測時，可參考上述方法去判斷訊號出現異常的原因，順便瞭解樣品品質是否已發生變化而對結果造成了影響，這樣可以提前釐清狀況，讓後續工作更加順利。

圖一、有勁實驗室以 Bio-Rad 自動電泳系統-Experion 檢測游離 DNA的觀察範例

波形A、gDNA 汙染 cfDNA 檢體

波形B、品質濃度正常的 cfDNA

波形C、整體cfDNA濃度因癌細胞大量產生的ctDNA而提高

橫座標軸為儀器產生波形所花費的時間，越久代表DNA分子量越大。縱座標軸為DNA訊號的強度，越高代表DNA濃度越高。(圖片出處：洪郁豪/有勁基因)

參考文獻

1. Elazezy, M., Joosse, S.A. Techniques of using circulating tumor DNA as a liquid biopsy component in cancer management. Computational and Structural Biotechnology Journal. 2018 Oct; 16:370-378. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2018.10.002