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作者：林佑軒/有勁基因

　　NGS技術可以偵測血漿中的腫瘤游離DNA(ctDNA; circulating tumor DNA)，讓癌症病患在治療之後，仍能持續追蹤是否有復發的情況；但ctDNA在血漿所有游離DNA(cfDNA; cell free DNA)中的佔比極低，並不容易偵測。目前有一些特殊的文庫建構技術(library construction)─例如分子條碼(molecular barcode)，可以用來輔助NGS偵測血漿中這些比例極低的ctDNA，然而這些技術的要價恐怕並非一般民眾所能承擔，因此很難普及。如果不用特殊的文庫建構技術，改以較低廉的「低覆蓋率全基因定序(sWGS; shallow whole genome sequencing)」技術去定序血漿中的游離DNA呢？但這麼一來，就必須確定病人血漿中是否有出現癌細胞常見釋出的體染色體套數異常 (Somatic copy-number aberration, SCNA) ctDNA，且這些ctDNA在血漿中游離DNA的佔比至少必須超過1成才行；然而這樣的比例，只有在癌症晚期且未經治療的病患才有可能出現。治療後病人ctDNA在血漿中游離DNA的佔比極低，對這些病人來說，低廉價格的檢測方式是偵測不出來的，很難取代那些高價技術的檢測。

　　有勁部落格《長度篩選對偵測血漿中癌細胞游離DNA的效果》曾介紹過2017年英國劍橋大學團隊的實驗，他們透過異種器官移植(xenograft)發現大部分ctDNA的長度較血漿中其他游離DNA短了約20-40 bp，所以便想到利用長度篩選去選擇性篩選出「短片段的游離DNA」；篩選後，ctDNA在血漿游離DNA中的含量比提升，佔比放大了約5至11倍的幅度。該團隊之後在2018年新發表的文章中¹，以較低廉的低覆蓋率全基因定序去比較病患在治療前後的血漿游離DNA狀況。治療前，病人血漿中有發現體染色體套數異常的ctDNA，如圖一A所示。治療之後，長度未經篩選過的病人血漿游離DNA中偵測不出體染色體套數異常的ctDNA (圖一B)；但經過短片段長度篩選後的病人血漿游離DNA中，就可偵測到體染色體套數異常ctDNA 的存在(圖一C)。

圖一、長度篩選可提高sWGS偵測血漿中存在體染色體套數異常ctDNA的靈敏度

橫軸標示的是染色體編號；圖中藍色區代表體染色體倍數有異常增加，橘色區代表出現體染色體倍數有缺失的情況。圖A為病患在治療前，血漿游離DNA未經長度篩選時的低覆蓋率全基因定序(sWGS)分析結果。圖B為治療之後血漿游離DNA未經長度篩選時的sWGS分析結果，可見到治療之前原本有測到的體染色體套數異常(SCNA)狀況，此時幾乎都無法看到。但病人治療之後，經過定序長度篩選的短片段游離DNA樣品，卻發現許多體染色體套數異常的腫瘤游離DNA(ctDNA)仍然存在病人血漿中(圖C)。(圖片來源：Mouliere, F. et al., Sci Transl Med. 2018 Nov; 10.1126/scitranslmed.aat4921)

　　該研究團隊接著又針對20個健康人與48個癌症病患，以t-MAD (trimmed Median Absolute Deviation from copy-number neutrality)統計方法將血漿中被低覆蓋率全基因定序偵測出有體染色體套數異常的ctDNA進行量化，數值越高代表ctDNA越多。結果如圖二A所示，長度篩選後，t-MAD數值約可提升1.1倍到6.4倍。在圖二B的受試者操作型特質曲線(ROC; Receiver Operating Characteristic Curve)方面，ROC曲線下方的面積─AUC (Area under the Curve)可以代表長度篩選的效益，亦即代表能正確判斷陽性樣本的機率，數值若越接近1(也就是，ROC曲線下方的面積越大時)，低覆蓋率全基因定序結果的正確性就越高²。長度經過篩選後，AUC值為0.97，未經長度篩選時，AUC值僅有0.64；可見長度篩選能明顯提升低覆蓋率全基因定序技術偵測出血漿中存在多少ctDNA的準確度。

圖二、量化統計長度篩選影響sWGS偵測血漿中存在多少ctDNA的能力

圖二A : 48個癌症患者(褐色圓點)與20個健康人(灰色圓點)的樣品分別比較在有無長度篩選情況下的t-MAD值。橫軸代表未經長度篩選的t-MAD值(X值)，縱軸為經長度篩選的t-MAD值(Y值)；t-MAD數值越高代表血漿中有越多體染色體套數異常的ctDNA被sWGS偵測出來。圖中大部分資料點的Y值都大於X值，結果顯示，長度篩選後，t-MAD數值約可提升1.1倍到6.4倍。長度未經篩選前，約半數的癌症病患樣品其t-MAD數值(X值)與健康人樣品相同，此代表若不做長度篩選，sWGS技術難以正確分辨健康人與癌症患者的樣品統計結果。圖二B：比較長度篩選後(金色)與未篩選時(綠色)的受試者操作型特質曲線(ROC曲線)，曲線下面積(AUC值)越大代表能正確判斷陽性樣本的機率越高。圖中顯示長度篩選過的AUC值明顯大於未經長度篩選的結果。即便是將未經長度篩選的定序資料於事後改用生物資訊方法移除長片段游離DNA的序列資料(in-silico size selection)，其AUC值雖比完全未篩選的結果大，但仍明顯低於有實際經過長度篩選的結果。(圖片來源：Mouliere, F. et al., Sci Transl Med. 2018 Nov; 10.1126/scitranslmed.aat4921)

　　由此可知，癌症病人的血漿樣品若能透過長度篩選步驟，篩出90-150 bp的短片段游離DNA，就可大幅提升偵測到的ctDNA比例，讓後續樣品處理及定序的成本大幅降低，即便是採用較低廉的低覆蓋率全基因定序都可以明顯提升正確判斷陽性樣本的機率。如此一來，癌症患者在治療後，也有機會在可接受的價格範圍內，利用ctDNA偵測來監控復發的風險及狀況。除了追蹤癌症患者治療後的狀況之外，未來或許也有機會應用在協助早期癌症的偵測上。

參考文獻

1. Mouliere, F. et al. Enhanced detection of circulating tumor DNA by fragment size analysis. Sci Transl Med. 2018 Nov; 10(466):eaat4921. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aat4921

2. Wikipedia. (2019 Nov). Receiver operating characteristic. Retrieved from https://en.wikipedia.org/wiki/Receiver_operating_characteristic