有勁的基因資訊

作者：林志鵬/有勁基因

場景：辦公室一隅。

人物：部落格總編輯(以下簡稱「編」)、本文作者(以下簡稱「帥」)

編：……….

帥：……………….

編：你確定要這個標題？

帥：Yes！(堅定貌)

編：不覺得這標題又鹹又濕嗎？

帥：No！(堅定貌)

編：你不要以為我不知道你又想要騙點閱率！你上次已經用了美女圖，這次又用這種像八卦雜誌的標題！(拍桌）

帥：It is science! (撥頭髮)

本文開始(警告：以下文字風格急轉)

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　　一般我們談到如何取得細胞游離DNA(cfDNA; cell-free DNA)時，第一個念頭是透過血液來獲得；雖說這方法相較於傳統活體切片來說，已經大幅減少受檢者的疼痛及受感染的風險，但畢竟還是要挨一針，因此不免讓人好奇是否有更輕鬆簡易的採檢方式。其實早在20年前的西元2000年就有研究指出，cfDNA可以穿過腎臟屏障進入尿液中¹，因此對那些有針筒恐懼症的人來說，如果能透過尿液取得cfDNA，絕對是一大福音。

　　膀胱癌，是全球第9大最常見惡性腫瘤、也是第13大最常見的癌症死因^2,3。血尿，是膀胱癌的標誌性症狀，但臨床上所觀察到的血尿病例，其實只有3％至28％是由膀胱癌所引起^4,5；因此目前判讀膀胱癌的金標準並不是血尿檢測，而是膀胱鏡檢查Cystoscope (如下圖一所示)。然而，膀胱鏡檢查除了具侵入性會帶來疼痛、以及價格昂貴這些缺點外，這個檢查在腫瘤早期的檢測上，準確性並無法達到百分之百。

圖一、膀胱鏡檢查示意圖

圖片來源：Mayo Clinic. (2018 Aug 22). Cystoscopy. Retrieved from https://www.mayoclinic.org/tests-procedures/cystoscopy/about/pac-20393694

　　相信各位男性同胞，看了上圖以男性為例的示意圖應該會頭皮發麻…作者想到日本漫畫《麻辣教師GTO》⁶故事裡那位可憐的內山田主任長期為血尿所苦；假如得一直去做膀胱鏡，那真的只能在他的額頭上寫個慘字。

　　今年(2020年)有一篇文獻就嘗試去探討利用尿液中的cfDNA去檢測膀胱癌的可行性⁷。為了從血尿病患的檢體去準確偵測是否罹患膀胱癌，作者一共收集了125個有血尿徵狀的病患，其中92個已知罹患膀胱癌的患者作為實驗組，剩餘33個非膀胱癌病患為對照組。作者將研究分成三個階段：先導研究(Pilot Study)、主要研究(Main Study)、診斷模型確認(Diagnostic Model)；如圖二所示。

圖二、計畫流程概述

該研究包括三個階段：先導研究、主要研究和診斷模型的最終確定，分別以灰色，藍色和紅色表示。(圖片來源：Ou, Z., et al. Clinical and Translational Medicine. 2020 Jan;9(1):4-15.)

    作者在先導研究時，從實驗組的92個膀胱癌患者裡挑選出16個病人(14個男性、2個女性。年紀介於51歲～84歲，平均年齡67歲)，然後從四種不同來源分別採集他們的DNA檢體，這四種檢體分別為腫瘤細胞DNA(cellular DNA)、尿液上淸液中的細胞游離DNA(cfDNA)、尿液沉澱物中的細胞游離DNA、以及血漿中的細胞游離DNA；然後各分別進行150個與膀胱癌高度相關的DNA位點檢測(這些位點分別坐落在48個基因上)。從尿液上清液或沈澱物cfDNA上所偵測到的基因突變情況，明顯高於從血漿cfDNA檢體測到的結果，且相較起來，尿液檢體的偵測結果和腫瘤細胞檢體的結果更為相近 ，如下圖三所示。除了突變比例(數量)之外，作者從先導研究結果也證實在膀胱癌病患尿液cfDNA所發現的突變型態，與在癌細胞DNA所看到的結果相當一致。

圖三、四種來源不同的DNA定序結果

四種不同來源的DNA經過定序後所偵測到的基因突變比例(數目)。由圖可看到，從尿液cfDNA所測得的基因突變情況比從血漿cfDNA所測得結果的明顯來得高，且相較起來，尿液檢體的偵測結果和腫瘤細胞檢體的結果更為相近。(圖片來源：Ou, Z., et al. Clinical and Translational Medicine. 2020 Jan;9(1):4-15.)

　　根據上述先導研究，作者指出：來自尿液的cfDNA比來自血漿的cfDNA更能正確反應出膀胱癌細胞的突變狀態。於是作者接著就在主要研究階段對這125個有血尿徵狀的所有受檢病患進行尿液上淸液和沉澱物檢體的採集，並萃取出cfDNA進行和先導研究相同的基因檢測；結果從上淸液檢體和沉澱物檢體中分別找到19個和15個突變基因。

      為了建立診斷模型提供給臨床檢測應用，作者先利用random forest(隨機森林)機器學習演算法將主要研究階段中找到的這些基因(上淸液19個基因、沉澱物15個基因)根據和膀胱癌關聯性的高低進行排序；接著再將125個病人的尿液檢體分成訓練(Training)和驗證(Validation)兩組^備註1，然後利用logistic model(對數模式)去針對尿液上淸液和沉澱物檢體建立臨床預測模型，看看如果想要達到最好的罹癌預測效果，究竟需要確認多少個發生突變的基因。經過一連串處理演算之後，作者發現要從尿液上淸液檢體得出最好的罹癌預測效果，得先確認TERT、FGFR3、TP53、PIK3CA、KRAS這相關性排名前五的基因有變異發生才行；至於尿液沉澱物檢體則至少需要確認TERT、FGFR3、TP53、PIK3CA、KRAS、HRAS、ERBB2這排名前七的基因變異。如下圖四所示。

圖四、變異基因數量與尿液上淸液、沉澱物的檢測效果

尿液上淸液(Supernatant)及沉澱物(Sediment)檢體在訓練組及驗證組中可見到的罹癌預測效果。從上淸液檢體的模型演算結果(左上及左下圖)，我們可以看到當突變基因數涵蓋膀胱癌相關性排序前5個基因時，所有的五個預測數據值都能達到最高峰。而從沉澱物檢體演算模型(右上及右下圖)來看，則至少需涵蓋前7個基因，所有的預測數據值才會達到最高 (圖片來源：Ou, Z., et al. Clinical and Translational Medicine. 2020 Jan;9(1):4-15.)

　　作者也觀察到，除了上述基因數據外，如果再將「性別」及「年齡」資料加進模型演算，就可讓預測效果更往上提昇。如下圖五。

圖五、將「性別」及「年齡」資料加入模型演算後的結果

紅色線條為加入性別資料的演算結果；綠色線條為加入年齡資料的演算結果。藍色線條為同時加入「性別」及「年齡」資料的演算結果，此時罹癌預測效果最佳。(圖片來源：Ou, Z., et al. Clinical and Translational Medicine. 2020 Jan;9(1):4-15.)

　　從這篇研究我們可以看到，臨床上利用尿液cfDNA檢測去協助診斷膀胱癌是非常具有潛力的。我們無法天天做膀胱鏡，但是我們絕對可以天天尿尿！讓我們一起期待更多從不同來源取得的cfDNA所延伸出來的臨床應用吧。

　　從此之後，內山田主任終於可以輕鬆方便地確認他的血尿是膀胱癌所造成，還是被鬼塚英吉氣的！真是可喜可賀～

【備註1】

機器學習的過程中，電腦程式會對「訓練組」根據其資料特性找出最佳的學習參數組合，電腦會一邊調整參數，一邊檢查這些參數被套用在「訓練組」資料上的預測結果，直到找到最佳參數組合為止。接著電腦再將確認過的最佳參數組合套用在「驗證組」的資料上去預測結果。由於「驗證組」的資料先前並未曾參與參數最佳化的過程，因此所得到的預測結果被認為是可信賴的。一般來說，「驗證組」所得到的預測結果會略遜於「訓練組」的預測結果。

參考文獻

1. Botezatu, I., et al. (2000 ). Genetic analysis of DNA excreted in urine: a new approach for detecting specific genomic DNA sequences from cells dying in an organism. Clinical Chemistry. 2000 Aug;46(8 Pt1), 1078-1084. Retrieved from https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10926886/

2. Jemal, A., et al. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2006 Mar;56(2):106-130. Retrieved from https://doi.org/10.3322/canjclin.56.2.106

3. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 2015 Mar;136(5):E359-E386. Retrieved from https://doi.org/10.1002/ijc.29210

4. Price, S.J., et al. (2014). Non-visible versus visible haematuria and bladder cancer risk: a study of electronic records in primary care. Br J Gen Pract. 2014 Sep;64(626):e584-e589. Retrieved from https://doi.org/ 10.3399/bjgp14X681409

5. Khadra, M.H., et al. A prospective analysis of 1,930 patients with hematuria to evaluate current diagnostic practice. The Journal of Urology. 2000 Feb;163(2):524-527. Retrieved from https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10647670/

6. Wikipedia. (2020 Apr 29). 麻辣教師GTO. Retrieved from https://zh.wikipedia.org/wiki/麻辣教師GTO

7. Ou, Z., et al. Detection of bladder cancer using urinary cell-free DNA and cellular DNA. Clinical and Translational Medicine. 2020 Jan;9(1):4-15. Retrieved from https://doi.org/10.1186/s40169-020-0257-2