作者：鄭翰欽/有勁基因

 

　　 牛津奈米孔技術 (Oxford Nanopore Technologies；以下簡稱ONT)，為史上第一個利用「不同時間點的電流值變化」來偵測序列內容的定序技術(其原理可參考有勁部落格《第三代定序儀Oxford Nanopore》)。由於ONT產品在2017年之前的定序錯誤率較高(accuracy≦90%)，當時筆者對此項技術的感想為：有潛力但還不具實用性。然而近日聽取ONT台灣代理商蘇秉堉博士對ONT定序品質、特性與應用的介紹後，從此對Oxford Nanopore技術的印象大為改觀，也對ONT產品的應用多了幾分期待。以下先為大家針對ONT的定序品質與特性做個簡介。

 

定序品質

　　ONT定序原理是利用DNA/RNA在不同時間點通過帶電的奈米孔洞時所產生的離子電流訊號(ionic current signals)去偵測鹼基，再利用軟體針對這些電流訊號所對應的序列模型去譯出序列內容，如圖一所示 1。

 

圖一、ONT定序過程

210520_01.png

ONT定序過程中，(A)動力蛋白(motor protein)會將雙股DNA打開，形成單股DNA通過奈米孔洞，感測器就會去偵測孔洞中流動的離子電流(ionic current)。(B)當一批批DNA序列通過時，原始的離子電流訊號會成間隔式分段發出，各段電流訊號會被當作不連續事件進行偵測並紀錄成統計數據。(C)被紀錄到的各段「事件」就會採用機器學習模式進行分析(如黑盒子所示)，然後(D)輸出分析後所得的樣本序列及互補序列結果。(圖片來源：Magi, A. et al. Briefings in Bioinformatics. 2018 Nov;19(6):1256-1272)

 

 

　　因此能否正確產生並解析這些電流訊號，就成為了定序品質好壞的關鍵因素。對此，ONT技術團隊從以下兩方面著手改進：

一、奈米孔洞結構的改進

　　電流訊號偵測的靈敏度與奈米孔洞的結構息息相關。若奈米孔洞結構設計不好，則自原始訊號起就無從獲得足夠的細節；如此一來，不管分析軟體再怎麼厲害，都無法解析這些偵測靈敏度原本就不好的訊號。因此ONT團隊召集了許多蛋白質結構專家，針對奈米孔洞的結構進行改進，提升了訊號的靈敏度，ONT序列解析正確性從此提高到90%以上，如圖二所示2。

 

圖二、ONT產品提升奈米孔洞與訊號靈敏度的演進圖

210520_02.png

2015年之前，受限於硬體效能不足、演算法以及奈米孔洞設計的缺陷，導致序列偵測的正確性(Y軸：Accuracy)只落在60%~75%之間。2015到2016年中，透過正股與互補股都進行定序的方式(又名「2D」技術3，如圖中空心圖樣所示)去提高正確性。直到2016年中後期R9版本的奈米孔洞問世後，序列解析的正確性才提升至90%。(圖片來源：Rang, F.J. et al. Genome Biology. 2018 July;19:90-100)

 

 

二、建立良好的訊號解析模型

　　獲得細節夠多的電流訊號之後，接下來就要解析這些訊號。早期由於電腦運算效能不強，能收集到的訓練集(training set)也不足，因此無法對這些訊號做有效的解析。拜硬體效能進步與類神經網路(Neural Network)發展所賜，如今ONT已經可以有效的解析這些訊號，將正確性提高到95%以上(見下圖三)4。

 

圖三、演算法對序列解析正確性的影響

210520_03.png

ONT本身有開放給第三方進行軟體的編寫，各團隊皆可以提出自己的演算法來提高序列解析的正確性。Guppy為ONT官方的解序軟體，其序列解析的正確性可以達到94%以上(最下圖)。PoreOver則是其他研究團隊根據類神經網路演算法所提出來的解序軟體，其團隊宣稱若搭配Bonito類神經演算法，序列解析正確性可以到98%以上(中間圖)。(圖片來源：Silvestre-Ryan, J. et al. Genome Biology. 2021 Jan;22:38-43)

 

 

產品特性

1、定序執行上的彈性

　　不像PacBio®、Illumina、Thermo Fisher等平台，得先收集完訊號並解析後才能取得定序資料；ONT是利用電流訊號去進行序列解析，故在定序的當下就能直接看到序列資料，因此對ONT來說，無論是要執行定序或是停止定序，都是按一下按鈕就能解決的事情。這裡大家或許會問，在ONT定序過程執行到一半時把它中止，難道不會浪費掉已經定序的晶片嗎？事實上，ONT晶片的壽命是取決於它上面的奈米孔洞是否阻塞；只要孔洞沒有塞住，那麼只需要「清洗」一下，晶片就可以繼續再拿來定序了。

 

2、定序長度

　　PacBio® HiFi reads的定序長度可達到25 Kb5，這其實已經讓人覺得相當驚豔了；ONT則更上一層樓，官網宣稱他們的定序最長能達到4 Mb6，這樣的長度對基因體組裝尤其有利。

 

3、產品的可攜帶性

　　ONT產品由於定序原理之故，整體設備可以做到小型化。例如MinION，這個外接式定序產品就小到足以放進口袋帶著到處走(圖四)7；至於序列的解析，交給筆記型電腦去進行即可。倘若擔心運算效能不夠，也有MinIONMK1C這類的二合一產品，出門時只要帶上這台就夠了。

 

　　ONT產品的這些特性對於野外生態調查與流行性疾病調查有極大的幫助。在PacBio與次世代定序(Next-generation sequencing; NGS)仍是主流的時期，想要解析樣本的基因序列，得先把樣本的DNA/RNA抽取出來、保存並後送到定序中心才有辦法進行定序和分析。但MinION的出現，實現了在調查現場直接抽取樣本序列並定序的可能性；若想進一步分析比對，就直接將定序結果透過網路回傳資料中心進行比對即可。如此一來，既可省下樣品運送的時間，也大幅縮短了檢驗的時程。不過，由於室外的條件總是沒有實驗室好，所以奈米孔洞比較容易被雜質塞住，定序晶片耗損速度可能會比較快，所以一定要記得多帶幾片晶片以防萬一。

 

圖四、MinIONMK1C與MinION產品外觀

210520_04.png

MinIONMK1C(上圖)：長14 cm, 寬11.4 cm、高3 cm，約為一本口袋書大小。MinION(下圖)：長10.5cm、寬3.3cm、高2.3cm，約為一個摺疊梳子的大小。(圖片來源: Oxford nanopore technologies. (2021). MinION.)

       

 

　　聽完蘇博士對ONT的介紹後，筆者的感想是：ONT在定序執行、定序長度、與可攜性上的特有彈性，可望在流行性病學篩檢、野外調查等需要搶時間的現場定序領域闖下一片天地。例如英國目前就已經使用ONT產品在即時監控COVID19病毒株的變化上了8。

 

　　若ONT未來真有一天主導了現場定序這個市場，客戶都有自己的小型定序設備儀器可以隨時隨地進行定序，屆時或許由誰來「提供定序服務」已經不再那麼重要；反倒是，誰「有辦法為ONT產品客戶的定序資料提供有效快速的分析處理」，誰就有機會從這個市場勝出。

 

參考文獻

1、Magi, A. et al. Nanopore sequencing data analysis: state of the art, applications and challenges. Briefings in Bioinformatics. 2018 Nov; 19(6):1256-1272. Retrieved from https://doi.org/10.1093/bib/bbx062

2、Rang, F.J. et al. From squiggle to basepair: computational approaches for improving nanopore sequencing read accuracy. Genome Biology. 2018 July; 19:90-100. Retrieved from https://doi.org/10.1186/s13059-018-1462-9

3、de Lannoy, C. et al. The long reads ahead: de novo genome assembly using the MinION. [version 2; peer review: 2 approved]. F1000Research. 2017 Dec; 6:1083. Retrieved from https://doi.org/10.12688/f1000research.12012.2

4、Silvestre-Ryan, J. et al. Pair consensus decoding improves accuracy of neural network basecallers for nanopore sequencing. Genome Biology 2021 Jan; 22:38-43. Retrieved from https://doi.org/10.1186/s13059-020-02255-1

5、Pacific Biosciences of California, Inc. (2021). Delivering highly accurate long reads to drive discovery in life science. Retrieved from https://www.pacb.com/smrt-science/smrt-sequencing/

6、Oxford Nanopore Technologies. (2021). Product comparison. Retrieved from https://nanoporetech.com/products/comparison

7、Oxford nanopore technologies. (2021). MinION. Retrieved from https://nanoporetech.com/products/minion

8、Oxford nanopore technologies. (2021 Jan). News: Mobile laboratories use LamPORE COVID-19 test, UK Government LamPORE evaluation report shows high accuracy. Retrieved from https://nanoporetech.com/about-us/news/mobile-laboratories-use-lampore-covid-19-test-uk-government-lampore-evaluation-report

 

 

 

 

thumbnail_官網用CC創用_ND_YH.png

arrow
arrow
    文章標籤
    Oxford Nanopore Technologies Oxford Nanopore ONT Third generation sequencing 第三代定序儀 第三代定序 定序儀器
    全站熱搜
    創作者介紹
    創作者 TIGS 的頭像
    TIGS

    有勁的基因資訊

    TIGS 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

    E-mail轉寄