在 RNA 樣品製備 NGS 定序上機的前端作業方面，Illumina 所採用的方式是使用 Oligo-dT 來篩選出帶有 PolyA tail 的 mRNA，然而這種方式面對品質較差的 RNA 時，將會受到限制，並且一些不帶有 PolyA tail 的 mRNA，將無法被觀察到，因此有其他廠商使用其它的策略發展新的製備方式，如：NuGEN Ovation，它可以使用少至 500 pg 的 RNA 來完成 library，並且即使 RNA 品質較差，依然可以適用。
圖一、 NuGEN 開發Ribo-SPIA 技術轉成雙股 cDNA
NuGEN 開發的Ribo-SPIA 技術，使用了特殊的引子，針對 mRNA 轉換成第一股 cDNA，再利用引子 5’ 端專一的序列，進行互補股的合成，隨後在 RNAseH 與 polymerase 酵素作用下，最終獲得約 5 μg 的雙股 cDNA (見圖一)。
隨著 library 製備的方法不同，會產生以下幾個疑問：
1. 這是否會影響基因表現量的差異？
2. 是否會影響 SNV (single nucleotide variation) 的偵測？
3. 在分析 non-coding RNA 時，NuGEN 是否比 poly-A 的製備方式來的優勢？
以 8 種不同處理的 RNA 樣品，分別使用Illumina 及NuGEN 的 protocol 製備後，同樣在 Illumina 平台上定序，並分析結果統計資料，Illumina 的 Mapping rate (90％) 較 NuGEN 高 (75％)，而被偵測到的基因種類數來說，Illumina 較 NuGEN 多出 12-20%，而在這兩種製備方式所定序出的基因，使用 RPKM 分析後呈現表現量，PolyA 的 protocol 相較於 NuGEN 的基因表現趨勢來的高 (圖二)，除此之外，兩種製備方式所定序獲得的基因數，在 PolyA protocol 有2160 個基因無法在 NuGEN 中被找到，相反的，在 NuGEN 中有376 個基因無法在 PolyA 中被找到，這個結果顯示了 PolyA protocol 的基因多樣性是比較好的。
圖二、 (左圖) RPKM normalize 後 poly-A protocol (.pa) 在八個樣品間平均基因表現量較 NuGEN protocol (.ng) 為高。(右圖) 以BSO19B 樣品為例，各基因表現量傾向用 poly-A protocol (.pa) 較 NuGEN protocol (.ng) 高。
偵測 RNA-seq 資料中的 SNVs 在某些方面是具有意義的，例如：腫瘤樣品，也因此製備方式的不同若影響 SNVs 的判讀，有可能對結果的解釋有不一樣的影響，在 PolyA protocol 方面，平均每個樣品有 30,000 個 variants 被觀察到，但在 NuGEN 中卻有 PolyA 結果的 5-6 倍 variants 被觀察到，而將它們互相比較後，發現相同 SNVs只有 30％ (圖三)，若更進一步研究，可發現兩種 library 的 SNVs 在 coding regions 的相似度極高，但在 intergenic 和 intragenic regions，NuGEN library 的 SNVs 就比 PolyA 高出 23.5 (intergenic) 和 12.7 (intragenic) 倍 (圖四)。
圖三、NuGEN 比較 PolyA SNVs，結果發現相同 SNVs只有 30％。
圖四、在 intergenic 和 intragenic regions，NuGEN library 的 SNVs比 PolyA 高出 23.5 和 12.7倍
NuGEN protocol 相較於 PolyA protocol有一項潛在的優點，那就是NuGEN 可能能夠觀察到缺少polyA tail 的基因，為了查證這一點，將 command gene 拿掉後，兩種protocol 的 additional gene，polyA 有 7600 個對上 NuGEN 6900 個，polyA 較 NuGEN 明顯多出的基因大多屬於 coding protein、lincRNAs、antisense RNA (圖五、標示＊者)，相反的，NuGEN 大多屬於 pseudogenes、snRNA、snoRNA、mics RNA、miRNA (圖五、未標示＊者)。另外，雖然在 lincRNAs 的種類發現上，polyA 較 NuGEN多，但是若是研究資料庫尚未知的 non-coding RNA 時，NuGEN protocol 具有較多 “Novel” 的 lincRNA。
圖五、PolyA (.pa) 及 NuGEN (.ng) protocol 的 additional genes 種類比較
使用 NuGEN 製備 NGS RNA library 有著 input 門檻低、可使用降解 RNA的優勢，而這是 polyA 的製備方式的弱點，但當 RNA 品質同樣優良時，研究基因種類及表現量差異， NuGEN 的製備方式可能會損失一些基因，更進一步研究 SNVs、fusion gene、alternative splicing 時，由於 coverage 的不平均更有可能影響結果正確性的判讀，因此研究學者們選擇製備流程時，更需要好好的判斷適合自己樣品及實驗的方式，才能獲得最貼近事實的實驗結論。
Reference:
Sun Z, Asmann YW, Nair A, Zhang Y, Wang L, et al. (2013) Impact of Library Preparation on Downstream Analysis and Interpretation of RNA-Seq Data: Comparison between Illumina PolyA and NuGEN Ovation Protocol. PloS one 8: e71745.
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