有勁的基因資訊

在Ion torrent 定序平台中，要定序之前，要先做出成功的 emulsion PCR，才有可能有好的定序品質 ， 但首先要克服以下情況:

        1.  Micro-reactor 必須有一致的大小 :

emulsion PCR 是利用油滴包覆Emulsion PCR 必須所含的物質，包含Bead、 一條 DNA template、d NTP、DNA polymerase、co-factor 等等。這樣的一個反應油滴我們稱之為 micro-reactor。一般而言，micro-reactor 的大小約在 20-30 um ， 這樣的大小已經足以提供 Emulsion PCR 一個很好的反應環境。 micro-reactor 若是太大，就會容易造成 polyclonal 的形成 ( 即一個micro-reactor 裡面含有兩條不同的 DNA template，使同一個bead上會有兩種不同序列的 template，造成定序時判讀微弱或混亂 )。

micro-reactor 也不能太小，太小的反應空間雖然可以減少 polyclonal 的形成，卻會使一些emulsion PCR 所需的 co-factor 無法存在於micro-reactor 中，使的Emulsion PCR效率減低。

現有的Ion torrent 定序平台，是將油和水利用壓力通過孔洞小的filter，形成大小均一的micro-reactors。

2.  在高溫的PCR過程中，可以有穩定的乳化狀態(emulsion)。

Emulsion PCR 所形成之 micro-reactors ，可謂是水中有油，油中有水的乳化狀態，如下圖一。

(圖一)

 理想的Emulsion PCR ，不應該為PCR 過程中的高溫被破壞其乳化狀態，所以其油的選擇是很重要的，油必須有耐熱性( thermostable) 。 因為水分子遇熱會有顫動導致泡泡的破裂，若油此時也在高溫之下一起不穩定，便容易使的 micro-reactors 漸漸地聚集成一個大的水滴，這樣的 micro-reactor 便因為太大而形成之前所提的polyclonal 形成條件之一 : 擁有兩條不同DNA template 的 micro-reactor。

 此外，要是micro-reactors 聚集的情況太嚴重，便會產生油水分離的狀態，例如圖二。

(圖二)

另外，油和水的比例也是會不會造成油水分離的原因之一，以PGM為例，水和油的比例為1:4 是一個恰當的比例。 

1. PCR之後的beads 回收率。

Emulsion PCR時必須有耐熱性高的乳化狀態，但是這樣的穩定狀態在我們要回收 beads 時是一種阻礙，所以必須有好的detergent 將 micro-reactors 打破，卻又不傷及 DNA 。 醇類是一種好選擇， 以PGM為例， 是以丁醇 butanol 打破micro-reactors 然後將 beads 回收後以 SDS 清洗。

2. 減少在bead 回收時的粘著機率。

有時在回收 beads 會有 DNA 相互纏繞的現象，所以必須用detergent 將纏繞打開，不然也會造成定序的訊號混亂。當然，sonication 也是一個選擇，不過會傷害DNA 所以不太考慮。

 參考文獻； Optimization and Improvement of Emulsion PCR for the Ion Torrent Next-Generation Sequencing Platform. (2011) Jimmy Perrott.