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實驗上，我們時常使用 Polymerase Chain Reaction (PCR) 這項技術增幅目標核酸片段，這在建構NGS gDNA 或cDNA library時亦是其中重要的一環，然而實際上，進行 PCR 會因為兩種現象而機率性地產生非預期的結果：第一、在增幅過程中，片段小的 template 會傾向較容易地被放大；第二、經 PCR產生的產物有部分序列相似時，它們會在 annealing 的步驟中發生部份的雜合配對，而在extension 的步驟被 polymerase 延長，進而產生 chimeric副產物。此外，PCR 的過程中有時會伴隨 primer extension 不完整的產物產生，這樣的產物會在前述的部分配對中，在下一個 PCR cycle 繼續的被延長，但產生大小不一的 chimeric副產物。眾多的 PCR protocol 考量到上述現象，會適當地調整步驟，例如：提高 DNA模板的濃度或是降低 PCR 的 cycle 數，然而，當面對模板 DNA 極微量的情況時，就很難避免 PCR cycle 數的增加，而提高 chimera 出現的風險 (圖一、左)。

針對上述傳統 PCR 的弱點，新式的 PCR 方式被開發出現，利用油水不互溶的特性，製作出許多微小的水滴散布在油類溶液環境中，各種序列不同的模板 DNA 分子被隔離分開至各水滴中，每個水滴均為水性緩衝溶液並包含 PCR 過程所需的材料：DNA polymerase、primer、dNTPs，在適當的比例調配下，每個微小的水滴可少至僅含一條模板DNA 分子，使得每個水滴中的 PCR 反應互相不影響，只會忠實的放大同一條模板分子，所有的 PCR 產物平均地生合成且不會再因部分配對的雜合而被錯誤放大，PCR 反應材料不需競爭、也不因酵素催化的喜好性而出現偏向，徹底解決前述傳統 PCR 的問題 (圖一、右)。

為了進一步證實 emulsion PCR 優點，將 2 組同樣需要進行 PCR反應的 random DNA library，分別使用傳統 PCR 及 emulsion PCR 增幅，測試不同反應 cycle 數下 PCR 產物的變化，並以毛細管電泳及 SDS-PAGE 進行分析及比較，下圖二呈現使用上述兩種 PCR 方式後獲得不一樣的結果。在圖二、A之 SDS-PAGE 圖中可發現，傳統 PCR 在大約 14 cycles 開始出現非專一性副產物，並且隨著 cycle 數的增加時，副產物越來越多，專一性產物卻變得越來越少，在圖二、C 之 SDS-PAGE 圖中可發現，emulsion PCR 的專一性的產物在到達高峰後即使增加 cycle 數亦維持定量，並且幾乎不產生副產物。同樣的結果可同樣在毛細管電泳圖中發現，圖二、B 傳統 PCR 的專一性的產物 peak 隨 cycle 數增加越來越少，副產物卻越來越多，而圖二、D emulsion PCR的專一性的產物 peak 在 30 cycles 後維持固定量並且觀察不到副產物的產生。將 B、D 的結果數據化後以折線圖呈現，在 圖二、E 可明顯看到傳統 PCR 的專一性產物（藍線）與非專一性副產物（黑線）隨 cycles 數增加出現消長變化。

了解了 emulsion PCR 的好處後，接著嘗試不同濃度的 template對於反應是否會造成影響，圖三、A 嘗試使用 0.002、0.01、0.02、0.2、2 pmol/mL 的 template 進行 emulsion PCR，結果發現當 template 的濃度太濃時，即使使用 emulsion PCR 仍然會產生大量的副產物，回頭確認實驗條件，在光學顯微鏡底下可觀察到水滴在油溶液生成的直徑大約是 4 μm，而 100 μL 的 PCR 緩衝溶液大約可生成 3×109個單元，與前述 template 分子濃度相比的比例大約為 1:25、1:5、2:5、4:1、40:1（template: 水滴），由此可推斷，當越多的 template 被包裹進水滴當中進行反應時，副產物就越容易生成，在這個實驗當中最適合的 template 濃度，應該是 0.01 pmol/mL，也就是與水滴的比例在 1:5（template: 水滴）時，是最好的。

除了 template 濃度之外，我們知道 PCR 的要素還包含了 annealing 溫度、primer、Taq DNA polymerase，在一般的觀念當中，我們知道提高 annealing 溫度可以增加 primer 專一性，並且能夠盡量避免副產物產生，不過在 emulsion PCR 的測試結果中，50-70℃ 的變因下副產物的產生並沒有顯著的差異性。而另外在分別測試不同濃度下的 primer、Taq DNA polymerase 當作變因時，如果按照傳統 PCR 濃度配置，primer 變化濃度對產物生成的影響不大，過量也不容易生成副產物，但相較於傳統 PCR，Taq DNA polymerase 在進行 emulsion PCR時需要使用更多（<0.1 U/μL VS. 0.125 U/μL），若是濃度過低則會影響產物最終總量，而濃度過量對於結果並不影響。
最後用實驗驗證傳統 PCR 副產物生成的原因，當只有 template 時，進行 1 cycle、30 cycles 之後，template 會馬上變成 product-product 的副產物（圖四、lane 1,6），當 PCR 反應溶液不加 primer 時，進行 1 cycle、30 cycles 之後，一樣會將 template 變成 product-product 的副產物（圖四、lane 2,7），當 PCR 反應溶液不加 dNTPs 或是 DNA polymerase 時，進行 1 cycle、30 cycles 之後，會較容易出現 primer-product的副產物（圖四、lane 3,8 及 lane 4,9），當全部 PCR 要素充足時，在第 1 cycle 可看見 primer-product 的副產物先出現（圖四、lane 5），而後隨著 PCR 反應繼續進行，primer 被使用後剩下越來越少，在 30 cycles 後出現 product-product 的副產物變得越來越多（圖四、lane 10） 

Emulsion PCR 的出現，不僅能解決大多數傳統 PCR 的缺點，另外也被應用在 DNA 檢測，如：digital PCR，或是次世代的定序系統中，如：Roche 454、Ion torren，當然，在實驗的方便性及成本的考量之下，傳統的 PCR 仍有其應用的實際性，控制好 PCR 的實驗條件及要素，仍可以避免非專一性產物的大量生成，不過若是面對傳統 PCR 無法克服的弱點或極限時，也許就需要考慮嘗試不同方式來進行實驗，屆時，嘗試使用 Emulsion PCR 可能就是一項不錯的選擇。

Reference：
Shao K, Ding W, Wang F, Li H, Ma D, et al. (2011) Emulsion PCR: A High Efficient Way of PCR Amplification of Random DNA Libraries in Aptamer Selection. PLoS ONE 6(9): e24910. doi:10.1371/journal.pone.0024910
Williams R, Peisajovich SG, Miller OJ, Magdassi S, Tawfik DS, et al. (2006) Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR. Nat Methods 3:545–550