Circular RNAs (circRNAs) 簡介－有勁的基因資訊

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圖一: circRNA的生成及功能(圖來源: Wilusz, J. E., and Sharp, P. A. (2013). Molecular biology. A circuitous route to noncoding RNA. Science 340, 440–441. doi: 10.1126/science.1238522 )

Circular RNAs (circRNAs) 是一種環型的noncoding RNA (ncRNA)，早在1991年就有研究發現此類型的 ncRNA，但將近20多年來，人們對於circRNAs的了解依舊陌生，近兩年多篇研究使用NGS RNA-Seq的定序的技術，於哺乳動物細胞中找到大量的novel circRNAs，其研究成果也登上知名的期刊nature及science。

circRNAs的生成機制及功能可由上圖一說明，左半部是基因於細胞核內經過轉錄生成mRNA，circRNA則是經過backsplice circularization形成環型的RNA 。mRNA在細胞質內可被microRNA與其3’UTR的區域鍵結導致mRNA被degrade無法轉譯成蛋白質(上圖左下方)；circRNA則是能吸附microRNA (上圖右下方)，使得mRNA不被microRNA鍵結抑制 (此機制稱為microRNA sponge) 。backsplice的意思是指exon相接時並未遵循exon的順序，如上圖舉例，exon 3號是回頭與exon2相接。

近兩年多篇研究讓我們對於circRNA的特性有更多的了解，相關的特性如下

1. circRNA在細胞中是非常的穩定，多數的半衰期其為48個小時，而mRNA為10小時左右，但在血液中circRNA的半衰期不到15秒鐘。
2. 由於circRNAs沒有自由的5’及3’ ribonucleotide 端，如要定序樣品的 library製備會使用 rRNA-depleted而非傳統真核細胞中常用的polyA-enriched
3. circRNA的生成backsplice circularization 會遵循canonical splice site，如同Pre-mRNA的splice site GT-AG ，GT為donor(intron的5’端)，AG為acceptor(intron的3’端)，可參見下圖二

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圖二: pre-mRNA於splicing與circRNA於backsplice circularization上的相同之處 (圖來源: Sebastian Memczak et al., Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature 495, 333–338 (21 March 2013) doi:10.1038/nature11928 )

4. 目前發現在人類中找到的circRNA的上下游intron的區域發現有許多的ALU repeat
5. circRNA的生物功能已發現可和microRNA鍵結 (microRNA sponge)，如CDR1as及Sry，下圖三A的部分；也發現可能與RNA-binding proteins(RBP)的運輸(delivery)、儲藏(store)，分類(sort)有關，並參與調控基因轉錄等功能，下圖三B的部分。

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圖三: circRNA的生成及調控示意圖 (圖片來源: Matthias W Hentze1 and Thomas Preiss2,* Circular RNAs: splicing’s enigma variations. The EMBO Journal (2013) 32, 923–9250)

在William R. Jeck的研究中，提出了一種技術為”CircleSeq”的實驗及生物資訊流程來幫助找尋circRNA，

流程一：下圖四A

做法上是將RNA sample的library 使用rRNA depletion處裡，在分為有使用RNase R digestion(RNase R⁺ RNA)及沒有使用RNase R digestion(RNase R^- RNA)處裡的library進行Illumina paired-end定序

流程二:下圖四B

定序後的序列使用Mapsplice這套軟體找出reads有橫跨exon junction的可能性

流程三:下圖四C

經RNase R^- RNA處裡的結果為control組，alignment的結果為mRNA splicing的情形；而經RNase R⁺ RNA處裡的sample，挑出符合backsplice的mapping情況，也可參見下圖五，paired-end reads會橫跨兩個exon。從這實驗組及對照組的reads coverage可看出基因(RefSeq Gene)上面的哪幾個exon會形成circRNA

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圖四: CircleSeq的實驗流程圖 (圖來源: William R. Jeck et al., Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. Feb 2013; 19(2): 141–157. doi: 10.1261/rna.035667.112 )

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圖五: 利用discordant/improperly pair 所找到的circRNA (圖片來源: Julia Salzman et al.,Circular RNAs Are the Predominant Transcript Isoform from Hundreds of Human Genes in Diverse Cell Types. PLoS ONE 7(2): e30733. doi:10.1371/journal.pone.0030733)

當透過生物資訊的方法找出circRNA的candidates後，實驗的驗證可設計divergent的primer來調出產物(下圖i)，William R. Jeck提出使用不同實驗方法驗證circRNA時預期的實驗結果(下圖六ii~vi)

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圖六: circRNA實驗驗證的預期結果 (圖片來源: William R Jeck & Norman E Sharpless. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology 32, 453–461 (2014) doi:10.1038/nbt.2890)

Reference

1. Wilusz, J. E., and Sharp, P. A. (2013). Molecular biology. A circuitous route to noncoding RNA. Science 340, 440–441. doi: 10.1126/science.1238522
2. William R Jeck & Norman E Sharpless. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology 32, 453–461 (2014) doi:10.1038/nbt.2890
3. Sebastian Memczak et al., Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature 495, 333–338 (21 March 2013) doi:10.1038/nature11928
4. William R. Jeck et al., Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. Feb 2013; 19(2): 141–157. doi: 10.1261/rna.035667.112
5. Julia Salzman et al.,Circular RNAs Are the Predominant Transcript Isoform from Hundreds of Human Genes in Diverse Cell Types. PLoS ONE 7(2): e30733. doi:10.1371/journal.pone.0030733
6. Matthias W Hentze1 and Thomas Preiss2,* Circular RNAs: splicing’s enigma variations. The EMBO Journal (2013) 32, 923–9250