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作者：吳上豪/有勁生物科技

Flow cell是含有管道的一片玻璃，能提供空間給定序樣品在其中擴增產生叢集(cluster)，可說是Illumina定序的主要舞台；定序試劑在玻璃上的管道內流通，而定序便靠著偵測辨認各叢集所放出的螢光訊號來進行（請參考有勁部落格文章《次世代定序(Next Generation Sequencing, NGS)》）。Illumina於2014年推出patterned flow cell技術¹並將之應用在HiSeq X ten、HiSeq 3000、HiSeq 4000等較新的機型，降低了定序的成本。Patterned flow cell的特性，以及與舊式flow cell (non-patterned flow cell)之間究竟有何差異？本篇文章這就帶您了解。

舊式flow cell可用在MiSeq、HiSeq 2000/2500等機型上；定序樣品隨機散落在flow cell上進行橋式聚合酶鏈鎖反應 (bridge PCR)，其叢集擴增進行的過程好比放牛吃草，產生出來的叢集大小均不相同，有時還會互相重疊（如圖一所示）²。HiSeq 2500平台進行定序時，在第5個鹼基定序完成之後，會藉由偵測前5個鹼基的訊號，再花一個多小時去定義叢集的位置。此外，舊式flow cell需要注意定序樣品的上機濃度，上機濃度若過高，有可能造成叢集形成密度太高，各個叢集的位置因此無法被定義出來，定序結果就被儀器判定為「品質不良」，訊號因而被濾除。反之，若定序樣品上機濃度過低，則有可能造成定序資料量的不足。因此，調整出樣品最適的上機濃度才能確保定序的成功；這對實驗操作者來說，需要相當的經驗累積才能做到。

圖一、Non-patterned flow cell定序時的叢集(cluster)生長擴增示意圖

圖片來源：Illumina, Inc. (2015) Calculating Percent Passing Filter for Patterned and Nonpatterned Flow Cells.

相對地，Patterned flow cell則是在管道中設計了數以億計奈米級的小格子 (nanowell)，提供定序樣品擴增的空間（如圖二所示）^2,3。定序樣品與nanowell中的探針一旦雜合就會馬上進行擴增；由於樣品與探針的雜合，其速率遠低於樣品與探針雜合之後的擴增速率，因此同一格子中出現多種樣品擴增叢集的機會便可大大減少。為了Patterned flow cell，Illumina還配合其所使用的叢集合成方式，更新了試劑系統，讓定序成本降低，花費時間縮短；所以，對HiSeq 3000/4000/X機型來說，操作流程只要確認小格子內是否有螢光訊號傳出即可，不再像舊式flow cell那樣要去定義叢集的位置，定序時間減了不少。此外，由於各叢集的生長空間被小格子「規劃」好了，因此比較不需要擔心上機濃度過高造成失敗的可能性；同時還可以好好利用flow cell整片玻璃的空間，增加定序產出的資料量。

圖二、Patterned flow cell與定序時的叢集(cluster)生長擴增示意圖

圖片來源：Illumina, Inc. (2015) Patterned Flow Cell Technology.

由此可見，Patterned flow cell比起non-patterned flow cell，有著更高的資料產出量、更低的定序成本需求、更快的定序速度。看起來雖然好處多多，但Patterned flow cell並非完美，仍有一些需要特別注意的事項。在此先賣個關子，下回筆者的文章中再來說明，敬請期待。

參考資料

1.Hayden E.C. (2014 Jan 15) Is the $1,000 genome for real? Nature News. doi:10.1038/nature.2014.14530

2.Illumina, Inc. Technical Note: Informatics. (2015) Calculating Percent Passing Filter for Patterned and Nonpatterned Flow Cells - A comparison of methods for calculating percent passing filter on Illumina flow cells.

3.Illumina, Inc. Technical Spotlight: Sequencing. (2015) Patterned Flow Cell Technology - Fixed spacing of sequencing clusters with defined feature sizes contributes to increased data output, reduced costs, and faster run times.