NGS是目前最新且高通量的定序方法,所謂的NGS是指傳統定序法的改良版,而傳統定序法可以分成兩種來說明之。

 

第一種:Chemical Sequencing

 

第二種:Sanger Sequencing

 

 

 

我們就拿Sanger Sequencing來解釋何謂傳統定序法

 

Sanger1977年研究出鏈終止定序法(chain termintin),這是當時簡單又方便的定序法,同時也是奠定了現今NGS的基礎。此方法為:

 

(1)利用DNA當模板,分別將DNA分成4組同時加入DNA polymerase以及dNTP合成。

 

(2)分加入雙去氧核苷酸(ddATPddGTPddTTPddNTP)反應,雙去氧核苷酸           

 

  將會移除烴基,而於合成過程中隨機終止聚合反應,造成不同大小的DNA 

 

  段。

(3)透過電泳分析讀出待測物DNA序列。

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由於有以上的定序基礎,在80年代後出現了自動定序儀器

 

 

 

 

自動定序儀器在目前市面上可見到有IlluminaSolexaABISOLiD

 

Roche454,這些皆可稱為次世代定序儀(Next Generation Sequencing , NGS)

 

然而這三種代定序儀的原理都有些許不同,但不管是哪種都是採用鏈終止定序法(chain termintin)來進行DNA定序,不需要經由細菌進行質體複製,以減少錯誤發生率。

 

次世代定序儀(Next Generation Sequencing , NGS)是種最新的定序技術及概念,

 

藉由大量而快速來進行短序列片段(Short Reads)的定序。其原理(Illumina System)

 

(A)將待測DNA打斷成300-500bp片段,並於兩端接上adapter

 

(B)  將以接上adapter的片段,loding到表面帶有互補adapter序列的晶片(flow cell)上。

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*資料來源:Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008;9:387-402.

(C)透過橋式聚合酶鏈鎖反應進行增幅

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*資料來源:Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008;9:387-402.

(D)loding不同鹼基且標記特定可移除螢光分子的dNTP與反應試劑,重覆進行螢光標記移除與偵測,以達到快速且大量的定序結果。

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*資料來源:Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008;9:387-402.

 

 

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