全外顯子定序臨床應用案例分享 @ 有勁的基因資訊

作者：伊喬伶/有勁基因（有勁基因講座報導系列─游舒涵醫師講座）

案例（一）近親生育與胎兒結構異常

　　產前分子檢測的發展從早期大片段染色體異常的觀測，到DNA微陣列晶片技術的發展(DNA microarray)，再進展到全基因體定序(WGS; Whole Genome Sequencing)及全外顯子定序(WES; Whole Exome Sequencing)，每個階段都各有優缺點。然而，相較於目前其他的分子檢測，全基因體定序及全外顯子定序針對特定案例能更完整地偵測出胎兒的染色體變異。有勁基因股份有限公司(Yourgene Health (Taiwan) Co., Ltd.)在2019年台灣醫療科技展期間，邀請了林口長庚醫院婦產部游舒涵醫師分享該院婦產部醫師團隊們運用全外顯子定序技術於產前臨床檢測的經驗。

醫師簡介

　　游舒涵醫師畢業於長庚大學醫學系，獲有英國胎兒醫學基金會(FMF)第一孕期篩檢認證，現任財團法人長庚紀念醫院林口分院婦產部研究醫師；在產檢及接生之餘，也會投入產科醫學論文的撰寫並參與學會活動。展會中游醫師分享了兩起病人案例，第一個案例是「近親生育與胎兒生長結構異常」的產後胎兒致病研究，第二個案例是將孕婦「數次侏儒症胎兒的懷孕病史」與定序結果運用在之後的產前檢測。

摘要：近親生育與胎兒結構異常

　　游舒涵醫師與林口長庚婦產部醫師團隊利用全外顯子定序技術找到一個與合併短肋骨及多指症候群(Short rib-polydactyly syndrome)相關，但未曾被發表在文獻上的基因變異點位，該醫師團隊於2017年將"Identification of a c.544C>T mutation in WDR34 as a deleterious recessive allele of short rib-polydactyly syndrome."這篇研究發表在臺灣婦產科醫學會雜誌¹。

門診診斷

　　本案例的懷孕媽媽年僅15歲，她原先不知道自己有孕在身，直到懷孕第34週時，因肚子疼痛不已前往林口長庚醫院就醫。就醫後才得知她懷孕34週。在進行產前超音波檢查時，胎兒被觀察到有手腳長骨皆偏短以及心室中膈缺損的情況。胎兒在第36週時早產出生，其身材比例與正常嬰兒不太一樣，手腳長度比例上偏短，尤其在近端的部分，此外，還有多趾及胸廓凹陷的狀況。嬰兒在產後第1天及第4個月的X光檢測後證實有「胸廓較小」、「肋骨及長骨較短且彎曲」的狀況。因胸廓較狹小加上肺部發育不全(Lung Hypoplasia )，嬰兒在出生4個月時不幸過世。根據就醫記錄，這位媽媽除了本身有憂鬱症傾向(Major Depression)但沒有固定追蹤病情外，並無其他疾病，家族也沒有遺傳病的病史。

　　小兒科醫師最初開出兩個臨床診斷，認為嬰兒可能罹患了「窒息性胸腔失養症(Asphyxiating Thoracic Dystrophy; ATD)」，或是「合併短肋骨及多指症候群(Short rib-polydactyly syndrome)」。

檢測過程及基因變異的簡介

　　本案例使用基因晶片(Microarray)先確認父母為近親通婚生育，再找出可能導致隱性遺傳疾病的基因片段，檢測結果發現有134個變異點位可能與隱性遺傳疾病有關；之後再從這134個點位中找出與「合併短肋骨及多指症候群」臨床病徵吻合的基因變異，共列出了LBR、IFT172、CD96、WDR34這幾個候選基因。醫師團隊由OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man )與PubMed資料庫的過濾結果，確認WDR34以及IFT172與「合併短肋骨及多趾症候群」有關；由於IFT172變異還可能引發「腎結核導致的末期腎臟疾病」、「視網膜退化」與「肝纖維化」，但上述病徵並未在胎兒本體觀察到，所以先將IFT172基因變異排除掉。接著再應用全外顯子定序(WES)及桑格定序(Sanger sequencing)進一步確認，發現基因變異的確切點位就在WDR34的第544個核苷酸的位置(從C突變成T)。全外顯子定序的流程是在Ion Torrent平台進行操作，本案例偵測到645個體染色體的隱性變異以及313個胎兒新生突變；透過MalaCards人類疾病資料庫比對後，所有隱性變異中確認只有WDR34基因變異與「窒息性胸腔失養症」的發病最有關聯。

　　檢測結果直指的基因WDR34含有9個exons，而本案例的基因突變位於第4個exon上的128636919 (GRCh38)/131399198 (GRCh37)；根據SIFT與PolyPhen-2資料庫的分析預測，得知WDR34 c.554C>T的這個變異極有可能導致病害。為了確認全外顯子定序的結果不是誤判，因此又使用桑格定序再一次確認結果，同時一併了解其家族基因狀況，如圖一所示。

圖一、家庭中WDR34 c.554基因變異的帶原者

第一排左側顯示胎兒祖父基因為正常序列C/C，但是右側祖母卻為C/T，是基因變異的隱性帶原者。第二排為胎兒的父母，皆為C/T隱性變異帶原者。第三排的胎兒從其父母處獲得了T/T序列，因而引發疾病。(圖片來源：You, S.H. et al. PubMed. 2017 Dec; 56(6):857-862.)

　　NCBI的Clinical Variation原本已有記載WDR34有9個變異點位與合併短肋骨及多指症候群有關，但並無任何資料證明WDR34 c.544C>T與合併短肋骨及多指症候群的關聯。林口長庚婦產科醫師團隊的這個案例研究，為此變異點位與該疾病的關聯性提供了首例證據。

結論

　　本案例藉由基因晶片及全外顯子定序技術，找出因近親生育而引發胎兒隱性遺傳疾病的變異基因。基因晶片可以有效率地了解家族的遺傳模式，並找出與疾病相關的候選基因，而全外顯子定序技術可以更全面性地鑑定與疾病相關的基因與胺基酸突變，讓檢測結果更為精確。雖然此病症已有可參考的候選基因，但全外顯子定序可協助醫師們確定這個位點。假如未來有近親生育的特殊情況，也許全外顯子定序可作為諮詢的輔助工具。

參考文獻

1. You, S.H. et al. Identification of a c.544C>T mutation in WDR34 as a deleterious recessive allele of short rib-polydactyly syndrome. Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology. 2017 Dec; 56(6):857-862. Retrieved from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29241935