有勁的基因資訊

作者：林修平/有勁基因

　　俗話說：「民以食為天」，飲食不但攸關人類生存，安全高品質的食物更是維繫健康的基本。現代食品工業的製造流程日益複雜，食材從採集、儲藏、加工、運送，直到成為陳列在貨架上給消費者選購的食品，流程中的每個環節皆需謹慎，避免汙染。微生物汙染在食品中毒案例中是最主要的原因，也最容易造成大規模的集體食物中毒。日本雪印公司在西元2,000年時就曾因未將生產乳製品的設備清洗乾淨，而造成近1萬5千人集體食物中毒，罪魁禍首就是在生產設備內大量孳生的金黃色葡萄球菌。

　　次世代定序(Next generation sequencing; NGS)自2005年問世以來，由於技術的精進及定序成本的降低，其應用範圍不斷擴展；如今在食品微生物的檢測上，NGS早已成為不可或缺的重要工具。大量快速累積的微生物定序資料與資料庫，加上生物資訊軟體的開發應用，科學家們不但能更有效率地去追溯食品汙染源及汙染途徑，還能進一步預測汙染原的傳播狀況和可能產生的抗藥性，並依據這些資訊改善食品製程、包裝材料與運輸過程，以增進食品品質及安全，讓消費者獲得更多保障。

　　目前，NGS在食品微生物檢測領域的應用，主要有以下兩項：其一是由單一微生物分離株(可以是細菌株、病毒株或其他微生物)取得的全基因體定序(whole genome sequencing of isolates；簡稱WGS)。其二是由多種微生物株組成樣本所取得的總體基因體定序(metagenomics)。其中，總體基因體定序在食品安全的應用目前仍在發展階段，因此本篇文章將針對全基因體定序來進行介紹。

　　實驗室傳統鑑別微生物感染源的方式是用脈衝場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis;PFGE)去逐步建立病原的DNA圖譜，然後藉由血清型鑑定(serotyping)、分子型別鑑定(molecular typing)、毒力剖析(virulence profiling)等方式去進行檢測。有別於傳統這些追溯性的監測技術，全基因體定序能夠應付的感染原監測或樣本鑑定則更廣更多元，同時還能藉由建構資料庫，讓包括預測及防範的食安監控成為可能；因此全基因體定序目前已被英國、丹麥、法國及美國等國納入作為細菌性食品污染監測的應用技術。

　　細菌，在食品製造、運送或儲藏流程的諸多環節中都有機會大量繁殖。想要追查汙染的源頭，或是瞭解不同產線交叉汙染的可能性，就必須分析菌株間的DNA變異和演化，藉此建構出菌株間的種系發育樹(phylogenetic tree)以得知菌株間的演化關係。然而傳統的實驗方法僅能獲得非常零碎的基因體資訊，難以拼湊出食安事件的完整樣貌。相較之下，全基因體定序可在短時間內提供大量樣本菌株的基因體資訊，並能比較菌株間的基因差異，可幫助食品衛生管理人員更迅速找出汙染的源頭，並避免汙染擴大及爆發食安事件。

　　目前全基因體定序數據的分析，可採用SNP分析與GbG分析兩種方法並行。然而由於數據量龐大，不論哪一種方式皆需複雜的演算及程序，因此各有其優缺點及限制；簡介如下。

●SNP(Single Nucleotide Polymorphism；單核苷酸多型性)分析：

　　整個基因體不論編碼區或非編碼區皆要進行單核苷酸變異的比對，因此「參考基因體(reference genome)的選擇」對SNP這個方法來說非常重要。假若選到和樣本相關性較差的參考基因體，就會因為基因比對的結果較差而低估了相關性，最後推導出不正確的結論。此外，在比對SNP時也得注意排除諸如質體或噬菌體DNA等這些可動遺傳因子(Mobile genetic elements;MGE)的影響，以免這些可能並非來自垂直移轉的可動遺傳因子干擾到演化資訊的判讀，或者因為可動遺傳因子帶有高度重複的序列而讓比對的結果難以判讀。目前如美國食品藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration;FDA)、美國疾病管制與預防中心 (Centers for Disease Control and Prevention;CDC)、英格蘭公共衛生署(Public Health England;PHE)等單位皆有提供經驗證過的SNP分析工具，使用者可自行查詢使用。

●GbG(Gene by Gene；基因比對)分析：

　　GbG顧名思義是以基因為單位進行比對。基因的單核苷酸多型性、基因序列的插入與刪除(Insertions and deletions, InDel)、基因重組等，這些變異若來自單一基因，則皆視為變異型。也由於是以基因為單位進行比對，因此在獲得定序資料後，一般還需從頭組裝(de novo assembly)以獲得序列內容。這裡比對用的參考資料庫是由單一物種的眾多基因型所組成，因此較不需考慮參考基因體的問題；只不過目前有經過驗證的微生物相關資料庫仍不甚齊全便是。下表是目前食品汙染相關微生物的資料庫：

表一、食品汙染相關病原菌基因資料庫

(表格來源：Jagadeesan, B. et. al. Food Microbiology. 2019Jun; 79:96-115.)

　　現今已有許多生物資訊學工具可用來分析全基因體定序數據，其目的及功能各異。本文參考文獻的作者將大量工具及相關資訊整理並列舉在文獻的表格三¹，讀者可自行參閱。

　　NGS技術在食品安全管理及食品汙染防治的應用，必然會對全球食品工業及貿易產生相當程度的影響；這個應用在已開發國家的政府及相關單位加速推動下，讓消費者如今得以在貨架上挑選嚴謹檢測及認證過的食品。從另一個角度來看，許多食品加工出口國為開發中國家，若其檢測技術較不足、或者無力負擔較昂貴的檢驗及認證成本，食安管理就有可能產生實際執行上的困難或爭議。但隨著定序及分析技術的普及與成本的持續降低，這些困難應有機會循序克服，NGS平台未來在此領域仍有機會獲得更廣泛的應用及發展。

參考文獻

1. Jagadeesan, B.et. al. The use of next generation sequencing for improving food safety: Translation into practice. Food Microbiology. 2019Jun;79:96-115.Retrievedfromhttps://doi.org/10.1016/j.fm.2018.11.005