有勁的基因資訊

作者：鄭翰欽/有勁基因

　　環境中，各種微生物之間的交互作用其實比人們原本想像的更加複雜；不僅如此，和疾病有關的微生物與其宿主之間的交互作用，目前我們所知的，也只是冰山的一角而已。由於很多疾病和微生物關係匪淺，一直以來都有專家學者投入研究；近年來，環境微生物學更是成了顯學。對第一次踏入環境微生物分析這個研究領域的人來說，如何選擇適合的分析策略是個考驗。若因為對不同分析策略的各種限制不了解，以致選了不適當的策略，就可能事倍功半。本文要介紹給大家的是幾個常見策略的原理與用途，作為大家選擇方案時的判斷參考。

        環境微生物的分析大致上可以分成兩種，微生物相(Microbiota)的分析、以及總體基因體(metagenome)分析。

一、微生物相

　　微生物相分析，顧名思義，就是去分析環境樣本中的微生物組成。微生物(例如細菌)核醣體的核醣核酸(ribosomal RNA; rRNA)序列，在同物種間是沒有差異或差異極微小的；但在不同物種之間，彼此的差異就可以被區分出來了。因此，想要知道環境樣本中有哪些微生物，我們只要將其rRNA序列抽出來定序，然後將定序結果拿去跟rRNA序列資料庫(例如Ribosomal Database Project (RDP)、SILVA database、Greengenes database等)做比對，便可知道樣本中包含哪些種類的微生物了。然而，由於我們只定序了rRNA序列，因此像基因功能和代謝途徑這些資訊，實際上是無法從微生物相分析得知的。

        理論上來說，微生物物種間親緣關係越近，rRNA序列就愈相似；而親緣關係極為相近的物種，基因功能也不會差太多。於是就有研究團隊想到，假如我們手邊有個未知微生物物種，想知道它的基因功能的話，是否能利用微生物相分析找出與它親緣關係最接近、且基因功能已經知曉的已知物種，然後用已知物種的基因功能來代表未知物種的基因功能？基於這個推論，諸如PICRUSt¹的微生物相分析工具被開發出來了；但這些工具只是利用親緣相近的物種資料去進行分析，所得到的基因與代謝相關資料可能仍與實際狀況有所落差，這點需要特別注意。即便如此，PICRUSt不可否認的確大幅提高了微生物相分析結果的參考價值。

二、總體基因體

　　總體基因體分析是把環境樣本中所有微生物物種的基因體(genome)通通拿去定序並進行分析。由於是把總個基因體拿去定序，所以理論上應該可以得知樣本裡的所有基因。總體基因體分析又可細分成reference-based mapping and analysis以及de novo assembly and analysis兩種方式，分別說明如下：

1、Reference-based mapping and analysis

        此方式是將樣本定序出來的所有序列(Reads)拿去比對目前已知的微生物參考序列，然後進行分析，以得知樣本中包含哪些物種、其基因功能與代謝途徑。此方式一般來說需要的樣本定序量不會太多，約10 million reads就足以分析(但仍須根據樣本中微生物多樣性的高低來決定)。但缺點是分析結果會受限於參考序列資料的充分性；例如：人類腸道菌的參考序列充足，使用這種方式分析就可以得到精確的結果。但若分析的是海溝、或火星上的環境微生物，因為沒有相關的微生物參考序列資料，所以就無法用Reference-based mapping and analysis方式進行分析。類似此類環境微生物樣本，目前可以考慮利用MetaPhlAn²與HUMAnN³軟體的組合來分析，才有機會取得較多的微生物組成、基因功能、基因拷貝數以及代謝途徑等資訊。但要注意的是，分析的精確度可能也會隨著樣品來源不同而有所差異。

2、De novo assembly and analysis

　　此方式可針對沒有參考序列的微生物物種提供基因體定序；也就是能在沒有參考序列的情況下，直接拿定序出來的序列片段所提供的資訊去拼接組裝，還原出樣本中所有微生物的基因體樣貌及資訊(可參考有勁官網《探究未知物種發現生物多樣性》）。由於是直接進行組裝，因此理論上就算是未知的物種，也可以透過此方式去拼裝出該物種的基因體，進而分析推測其基因功能。當然了，實際情況還是會受到定序深度、該物種在環境樣本中的佔比等因素所影響。有鑑於此，專家們又發展出「數據分箱策略(binning method)⁴」方法來試圖還原出更正確的基因體資訊。當然也有軟體是將兩種方法結合再一起的，如metaSPAdes⁵等等。基因體組裝好後，接下來就可以透過傳統基因預測(gene prediction)與註解(annotation)等方法去分析環境樣本中微生物的基因功能了。

　　如果想要鑑別微生物物種，則可先利用MetaBat⁶軟體針對已拼接組裝好的序列(稱為Scaffold序列)去進行分群，然後再將這些序列拿去比對已知物種的基因體序列，看看該物種和哪個已知物種的序列最相像。假若這個序列跟所有已知物種的序列都對不起來，且組裝錯誤的可能性皆已排除，那恭喜你，你找到新物種了！

　　看到這邊，讀者們都眼花了沒？沒關係，下面表一有為大家大致整理比較了幾個環境微生物分析的策略；以後大家在做相關研究時，希望都可以針對實驗的需求、選擇適當的策略，然後順利得到結果。

表一、微生物分析策略比較

表格來源： 鄭翰欽/有勁基因

參考資料

1. Langille, M.G.I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 2013 Aug; 31(9):814-821. https://doi.org/10.1038/nbt.2676

2. Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 2012 Jun; 9(8):811-814. https://doi.org/10.1038/nmeth.2066

3. Abubucker, Sahar, et al. Metabolic reconstruction for metagenomic data and its application to the human microbiome. PLoS Comput Biol. 2012 June; 8(6): e1002358. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1002358

4. Albertsen, M., et al. Genome sequences of rare, uncultured bacteria obtained by differential coverage binning of multiple metagenomes. Nature Biotechnology. 2013 May; 31(6):533-538. https://doi.org/10.1038/nbt.2579

5. Nurk, S., et al. metaSPAdes: a new versatile metagenomic assembler. Genome Research. 2017 Mar; 27:824-834 http://www.genome.org/cgi/doi/10.1101/gr.213959.116

6. Kang, D.D., et al. MetaBAT, an efficient tool for accurately reconstructing single genomes from complex microbial communities. PeerJ. 2015 Aug; 3:e1165. https://doi.org/10.7717/peerj.1165