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大部分的循環DNA基因突變並非來自於腫瘤

作者：陳崇斌/有勁基因

　　循環DNA(circulating cell-free DNA; cfDNA)在醫學檢測上的應用日趨廣泛，最為人所知的是利用cfDNA去偵測腫瘤突變類型或是進行胎兒發育異常的篩檢(也就是NIPT)。目前在腫瘤液態活檢(tumor liquid biopsy)應用領域開發的重要方向之一就是利用cfDNA去檢測腫瘤；這是因為從cfDNA偵測到的基因突變與腫瘤組織中直接檢測到的基因突變有高度的一致性。不過，由於透過cfDNA偵測到的基因突變有很多並不存在腫瘤組織中，這個問題對cfDNA檢測效果的實際影響，還需要有更多前瞻性的臨床研究來證實或評估。Memorial Sloan Kettering Cancer Center(MSKCC)在前幾年就進行了這樣的前瞻性研究¹，試圖徹底釐清這方面的疑慮。

　　MSKCC研究人員總共招募了124位轉移性癌症患者，其中包括39位乳癌(MBC)患者、41位非小細胞肺癌(NSCLC)患者，44位攝護腺癌(CRPC)患者；此外還招募了47名並未罹癌的志願者，作為實驗對照。針對癌症患者，除了會進行癌組織定序去確認癌組織的變異，也會採集患者血液，進行cfDNA以及白血球(WBC)的超深度定序，其目標涵蓋率超過6萬倍(>60,000x coverage)，足以偵測任何可能的突變；而未罹癌志願者也同時做了相同的檢測(詳見圖一)。

圖一、實驗流程圖

實驗流程分為癌組織分析與血液檢體分析，其中血液檢體分析的部分(圖片中、下排)是針對cfDNA與白血球(WBC)的508個基因進行超深度定序(>60,000x coverage)，然後再搭配生物資訊分析去判定基因突變。(圖片來源：Razavi, P., et al. Nat Med. 2019 Dec;25(12):1928-1937.)

　　不出所料，實驗結果發現cfDNA的檢測結果和腫瘤組織檢測結果有不錯的一致性，在8成4(104/124位)患者的cfDNA中檢測出和腫瘤組織相符的基因變異；此外，7成2(530/740)的腫瘤组織的基因變異也能透過cfDNA被檢測出來(詳見表一)。令人感到意外的是，透過cfDNA所偵測到的基因變異，有許多其實是來自白血球的變異，而非源自腫瘤；尤其在未罹癌對照組與「非高度突變(non-hypermutated)註1腫瘤」患者血液中，一半以上所偵測到的cfDNA變異其實都是源自白血球(見圖二)。

表一、cfDNA與腫瘤組織檢測結果的一致性分析

圖片來源：Razavi, P., et al. Nat Med. 2019 Dec;25(12):1928-1937.

圖二、cfDNA突變分佈圖

作者將cfDNA檢體所偵測到基因突變類型分為四類(分別由粉紅、藍、黃、綠標示)。WBC matched 是指該基因變異有在白血球上找到；Biopsy matched與Biopsy subthreshold，則是在組織切片中可以找到的變異，只是biopsy subthreshold是需要調整偵測的閥值才能偵測到的變異；而VUSO (variants of unknown source)則是指只在cfDNA檢體才有偵測到的突變，無法確定變異來源。從左邊的圖可以看到，在並未罹癌的47人對照組(controls)血液中的cfDNA竟然偵測到365個變異，其中有297個是白血球的變異。而在共114位的「非高度突變(non-hypermutated)癌症」患者的cfDNA檢體中，有半數以上被偵測到的突變是源自白血球的變異。在10位高度突變(hypermutated)癌症患者的cfDNA檢體中，有超過四分之三的變異無法判斷來源。(圖片來源：Razavi, P., et al. Nat Med. 2019 Dec;25(12):1928-1937.)

　　這樣的結果凸顯出「利用cfDNA進行腫瘤偵測會產生偽陽性結果」的問題。由於大部分的cfDNA是來自白血球，而血球細胞在生成過程中，因為複製性造血作用(clonal hematopoiesis)而有機會製造出各種變異型的白血球，雖然比例不是很高，但是隨著年齡增加，發生這種情況的比例有可能高達31%，這對利用cfDNA所進行的相關檢測與應用都有可能造成影響。雖然可以藉由白血球細胞的定序結果來過濾源自白血球細胞的突變，但是，目前臨床上的cfDNA檢測並沒有涵蓋白血球細胞的定序分析(且還需搭配超高深度的定序)，可以想像一定會出現比例偏高的偽陽性問題。未來或許臨床cfDNA檢測就會搭配白血球定序分析，但可以預見其定序成本及要價必定不菲；這對於想利用cfDNA來做癌症早篩的計畫絕對是項挑戰，畢竟癌症早篩的目標客群是尚未罹癌的人，要如何降低檢測結果的偽陽性率、同時維持健檢等級的價格，可得要好好想想。

註1、cfDNA中基因變異數量大於22.7個/Mb，被歸納為高度突變(hypermutated, or high TMB)，反之則被歸納為非高度突變(non-hypermutated or low TMB)。

參考文獻

1. Razavi, P., et al. High-intensity sequencing reveals the sources of plasma circulating cell-free DNA variants. Nat Med. 2019 Dec;25(12):1928-1937. Retrieved from https://doi.org/10.1038/s41591-019-0652-7