有勁的基因資訊

作者：林佑軒/有勁基因

　　循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA; ctDNA)是腫瘤組織釋放到血液中的短片段DNA，雖然其確切的生成代謝機制至今仍然不明，但ctDNA的存在可以提供許多和腫瘤相關的訊息，且不需透過侵入性採檢，就能幫助及早發現腫瘤，或者在治療後協助腫瘤復發的監控。ctDNA目前可以提供的訊息究竟有哪些？從下圖一就能一見端倪。

圖一、ctDNA可提供的訊息

從血漿ctDNA的分析結果，我們能找出腫瘤相關突變、染色體倍數異常與染色體重組的現象。此外，源自不同組織的細胞擁有自己特有的甲基化型態，透過ctDNA甲基化分析，能推測腫瘤所在的組織；而利用ctDNA長度較一般游離DNA短的特性，可以進行長度篩選提升ctDNA的含量比例。另外，用次世代定序去分析轉錄起始點(transcription starting sites; TSS)上的定序深度，可以藉此推測基因的表現量；與病毒感染有關的特定癌症，也能藉由分析游離DNA是否含有病毒序列，提前預知罹癌的風險。(圖片來源： Keller, L., et al., Br J Cancer. 2021 Jan;124:345-358)

一、基因突變 (mutations)

　　偵測血液循環DNA(circulating cell-free DNA; cfDNA)是否含有腫瘤相關的基因突變，能幫助提早發現腫瘤的存在；而透過分析cfDNA 中ctDNA的基因變異，則可幫助了解腫瘤的特性與預後狀況。此外在選擇治療用藥時，亦可依照基因變異的種類，選擇合適的藥物或治療策略。不過就如有勁部落格《循環腫瘤DNA檢測的瓶頸》一文所提，許多透過cfDNA所偵測到的基因突變其實是源自白血球而非腫瘤，該如何降低檢測結果的偽陽性率仍是目前的一大挑戰。

二、染色體倍數與DNA結構性異常

　　腫瘤的基因體經常呈現染色體倍數異常(copy number aberrations)或DNA結構性異常(例如: 倒置(inversions)、轉位(translocations)、插入(insertions)與刪除(deletions))等現象，這些特性 ctDNA也有，因此偵測cfDNA中是否有染色體倍數與DNA結構性異常，也是癌症初期篩檢腫瘤的一種方式。然而據研究指出¹，ctDNA含量至少要在5%以上才有可能測出染色體倍數與DNA結構性的異常，而 ctDNA在cfDNA中所佔的比例有可能很低，尤其在腫瘤初期ctDNA實際含量比例甚至可能低於5%，所以檢測結果有偽陰性的疑慮。除此之外，由於未罹癌的人也有出現染色體倍數與DNA結構性異常的可能，所以想確定從cfDNA發現的異常究竟是不是從腫瘤來的，也是相當大的挑戰。

三、DNA片段化的型態(DNA fragmentation patterns)

　　我們在《去蕪存菁：長度篩選對ctDNA偵測的效益》一文曾提到ctDNA片段長度較其他cfDNA來的短，所以可以透過長度篩選去提高ctDNA的比例，進而提升各種檢測的正確性。除了DNA片段的長度，DNA片段化的型態也能用來推測重要腫瘤基因的表現量。如下圖二所示，用次世代定序(Next generation sequencing; NGS)去分析轉錄起始點(transcription starting sites; TSS)附近的cfDNA定序量，可以進一步推論出染色質(chromatin)的多寡。被定序到的cfDNA片段含量若較少，代表chromatin也較少，較有利轉錄的進行，該基因的表現可能較高。只不過，要想從cfDNA去分析某腫瘤的ctDNA特定基因表現量，該ctDNA在cfDNA的含量比例必須至少佔75%，才能正確進行評估²；但在自然情況下，ctDNA比例幾乎不可能達到這個程度，除非有特殊技術能精準且大幅地提升ctDNA比例，不然，要想實際執行這個應用其實是相當困難的。

圖二、從DNA 片段化的型態去推測基因表現量

A

B

圖二、 (A)用NGS去定序cfDNA， chromatin部分(水藍色)的定序深度(coverage)較深，代表被定序到的cfDNA片段主要是原本是包覆在組織蛋白(histone)上的DNA。(圖片來源³： Sun, K., et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 May;115(22):E5106-E5114)

(B)將NGS定序出的序列與參考基因體(reference genome)進行比對，分析轉錄起始點(TSS)附近的定序深度。右圖的TSS區域定序深度較低，表示chromatin分佈少，有利於轉錄的進行，所以能判斷該基因可能是高度表現的基因。左圖在TSS區域有定序到cfDNA片段，表示chromatin分佈多，不利於轉錄的進行，所以判斷該基因可能是低度表現的基因。(圖片來源⁴： Keller, L., et al., Br J Cancer. 2021 Jan;124:345-358)

四、DNA 甲基化(DNA methylation)

　　DNA甲基化是表觀遺傳編碼(Epigenetic code)的一部分，透過DNA甲基化位置的不同，可以讓相同基因體的細胞表現出不同的功能。不同組織、不同功能的細胞都各有其獨特的甲基化型態；研究指出⁵，甲基化型態相當穩定，細胞即便發生病變，例如癌化，也不容易改變其甲基化的型態。若將cfDNA的甲基化型態拿來比對人體各個組織的甲基化特有型態，可以分析出個別cfDNA片段的來源組織；利用這個特性，便能從找到的ctDNA去推測腫瘤可能存在於身體的哪個組織或器官⁶。不過要解開cfDNA的甲基化型態，其實驗費用高昂，且需要較長的時間去進行樣品處理及資料分析，想實際普及應用到臨床上，目前可能還是有困難。

五、病毒的DNA片段

　　有些癌症與病毒的感染有關，例如鼻咽癌與人類皰疹病毒第四型(Epstein-Barr virus; EBV)。在受到這些病毒感染後，人類cfDNA中也會測到這些病毒的DNA片段；因此分析cfDNA是否含有特定容易致癌病毒的DNA片段，也能提早提供醫師與病患警示。雖然感染這些病毒不代表絕對會罹癌，但這些資訊會是後續健康檢查頻率與策略的重要參考。有勁基因與香港Take2合作的Prophecy™檢測便是本於這個基礎而進行鼻咽癌的篩查。

　　分析ctDNA的確能提供我們許多的資訊，從中也能衍伸出許多的檢測應用，有機會讓病人透過抽血去提早發現腫瘤，甚至知道腫瘤的特性及後續用藥策略。不過這些資訊衍伸出的應用目前仍有不少侷限，例如高偽陽或偽陰性的問題。若想再提升結果的正確性，除了不斷進行技術改良，也需要更透徹地去研究與了解ctDNA的生成代謝途徑與特性並整合ctDNA的各種資訊。相信未來ctDNA的檢測應能像非侵入性產前篩檢那樣普及於一般民眾，在腫瘤初期提供具高度正確性的檢測方式。

參考文獻

1. Chan, K.C.A., et al. Cancer genome scanning in plasma: detection of tumor-associated copy number aberrations, single-nucleotide variants, and tumoral heterogeneity by massively parallel sequencing. Clin. Chem. 2013 Jan;59(1):211-224. Retrieved from https://doi.org/10.1373/clinchem.2012.196014

2. Ulz, P., et al. Inferring expressed genes by whole-genome sequencing of plasma DNA. Nat. Genet. 2016 Oct;48(10):1273-1278. Retrieved from https://doi.org/10.1038/ng.3648

3. Sun, K., et al. Size-tagged preferred ends in maternal plasma DNA shed light on the production mechanism and show utility in noninvasive prenatal testing. Proc Natl Acad Sci USA. 2018 May;115(22):E5106-E5114. Retrieved from https://doi.org/10.1073/pnas.1804134115

4. Keller, L., Belloum, Y., Wikman, H., and Pantel, K. Clinical relevance of blood-based ctDNA analysis: mutation detection and beyond.  Br J Cancer. 2021 Jan;124:345-358. Retrieved from https://doi.org/10.1038/s41416-020-01047-5

5. Epigenomics, R., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 2015 Feb;518(7539):317-330. Retrieved from https://doi.org/10.1038/nature14248

6. Sun, K., et al. Plasma DNA tissue mapping by genome-wide methylation sequencing for noninvasive prenatal, cancer, and transplantation assessments. Proc. Natl Acad. Sci. USA 2015 Oct;112(40):E5503-5512. Retrieved from https://doi.org/10.1073/pnas.1508736112