作者：金漢強/有勁基因

 

　　次世代定序技術為基因體研究及臨床檢測提供了可靠且價格可負擔的應用，但其在大範圍結構變異的偵測、核酸GC組成的特殊比例區域以及複雜變異區的偵測方面，仍然有所不足；而第三代的定序技術就可以應用在補足上述偵測領域上。第三代定序又被稱為「長讀取定序技術(Long-read sequencing)」，目前平均可以讀取大於10,000個鹼基(10kb)的序列長度。關於第三代定序的基本原理，可參考有勁部落格《第三代定序─ SMRT技術原理》與《第三代定序儀 Oxford Nanopore》的介紹。

 

　　在定序的世界裡，藉由放大、或富集特定目標區域所進行的定序，稱之為「目標區間定序(targeted sequencing)」；此種技術讓研究者可以專注在所關切的研究目標上，而不需要花費龐大的資源來處理基因體中其他與研究目標無關的序列。目標區間的定序，除了可以加深目標區間定序深度，還可減少總體定序的成本，基於這些優點，次世代定序系統的目標區間定序已經被廣泛應用於臨床，例如全外顯子定序、BRCA1/2基因檢測、以及各種癌症基因檢測等都是。用在次世代定序的目標區間定序，其方法主要是利用PCR放大目標區間、以及雜交技術(Hybridization capture)來達到目的。

 

　　第三代定序平台近年來也開始陸續發展目標區間定序的技術，讓研究者可以更自由的選擇所要研究的區間，這也使得長讀取定序技術在臨床的應用上變得更切合實際需求。2015年時已有研究學者嘗試以長片段PCR為主要技術去選擇性放大ATXN10基因上的ATTCT重複序列，並以Pacific Biosciences公司(簡稱PacBio)的單分子即時定序技術(Single Molecule Real Time ; SMRT)去研究此ATTCT重複序列的特殊結構。之後的研究者更將長片段放大技術的應用範圍擴及其他遺傳疾病、甚或是人類白血球組織抗原分型(HLA-typing)的研究。另也有研究者將想要放大的片段，放入可放大質體或細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome; BAC)中去進行目標片段的放大，再搭配長讀取定序技術進行研究1。

 

　　不過，PCR等放大的方法有可能會導入錯誤，且放大的過程並不包括原本鹼基上的修飾，於是科學家們開始對不需利用放大技術的目標區間定序進行方法開發。2017年，PacBio的研究人員發表了新的目標區間定序技術「No-Amp Targeted Sequencing」，這個技術並未使用放大技術，而是改用CRISPR-Cas9去富集目標區域2，如下圖一所示。2017年發表的這個方法先是利用限制酵素將基因體DNA(Genomic DNA)切成合適大小的片段，並製備成標準的SMRTbell文庫；接著再在CRISPR/Cas9系統中利用導引RNA將目標區間切下來。被切下的包含目標核酸片段的文庫(library)，會與接了用來可以捕捉目標文庫的序列的轉接子進行接合(ligation of capture adaptor)，然後再使用磁珠(Magnetic bead)去捕捉目標文庫(Magbead capture)，最後採以PacBio定序系統進行定序。

 

圖一 、PacBio於2017年發表的目標區間定序方法

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圖片來源：Tsai, Y.C., et al. bioRxiv. 2017 Oct;203919-203944

 

 

　　2020年，PacBio進一步優化了No-Amp Targeted Sequencing的流程，如圖二所示。流程改為先將核酸片段的兩端進行修飾，以避免轉接子(Adptor)的結合，接著使用CRISPR/Cas9系統利用導引RNA將目標區間切下，最後，進行SMRTbell文庫的製作與定序3。該公司並將此新方法成功應用在有重複序列擴增問題的疾病(repeat expansion disorders)檢測上。

 

圖二、PacBio官方網站目前所提供的No-Amp Targeted Sequencing流程

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圖片來源：Pacific Biosciences of California, Inc. (2020). PacBio Documentation- Human Biomedical Research

 

 

　　另一個第三代定序系統Oxford Nanopore也在相近的時間，發表了以CRISPR/Cas9系統為主、未使用放大技術的目標區間定序方法，如圖三所示。Timothy Gilpatrick 等研究學者先將基因體DNA(gDNA)的兩端去磷酸化(Dephosphorylation)，以避免非目標核酸片段在之後的接合步驟中接上轉接子；然後再以Cas9核蛋白微粒(Cas9 ribonucleoprotein particles; RNPs)將目標區間(Enriching regions of interest; ROI)切下；接著將帶有馬達蛋白(motor protein)的轉接子接上目標核酸片段，然後進行定序4,5。這個方法也被應用在諸如BRCA1的變異偵測上。

 

圖三、Oxford Nanopore所推出的未使用放大技術的目標區間定序方法

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圖片來源：Oxford Nanopore Technologies. (2020)

 

 

　　時至今日，第三代定序的目標區間定序方法儘管仍處於萌芽階段，但已經被成功應用在重複序列擴增類的疾病、以及大範圍結構性變異等偵測研究上。只不過，若要實際應用於臨床檢測，還需要更多的研究實證來確認方法的可靠性。此外，第三代定序本身的準確度、價格與分析方法的可及性，也是左右此技術能否普遍應用的重要因素。目前PacBio及Oxford Nanopore兩大主要第三代定序平台都持續在增進可定序量與降低價格，並且陸續藉由引入目標區間定序等方法來試著降低單一樣品的定序成本。相信在可預見的未來，第三代定序就會在臨床檢驗中扮演重要的角色。

 

 

參考文獻

1. Mitsuhashi, S., & Matsumoto, N. Long-read sequencing for rare human genetic diseases. Journal of Human Genetics. 2020 Jan;65(1):11-19. Retrieved from https://doi.org/10.1038/s10038-019-0671-8

2. Tsai, Y.C., Greenberg, D., Powell, J., et al. Amplification-free, CRISPR-Cas9 targeted enrichment and SMRT sequencing of repeat-expansion disease causative genomic regions. bioRxiv. 2017 Oct;203919-203944. Retrieved from https://doi.org/10.1101/203919

3. Pacific Biosciences of California, Inc. (2020). Application Brief: No-Amp targeted sequencing: Best practices. PacBio Documentation- Human Biomedical Research. Retrieved from https://www.pacb.com/wp-content/uploads/Application-Brief-No-Amp-targeted-sequencing-Best-Practices.pdf

4. Gilpatrick, T., Lee, I., Graham, J.E., et al. Targeted nanopore sequencing with Cas9-guided adapter ligation. Nature Biotechnology. 2020 Feb;38(4):433-438. Retrieved from https://doi.org/10.1038/s41587-020-0407-5

5. Oxford Nanopore Technologies. (2020). Cas9 sequencing kit (SQK-CS9109): Workflow. Retrieved from https://store.nanoporetech.com/catalog/product/view/id/461/s/cas9-sequencing-kit/category/28/

 

 

 

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