有勁的基因資訊

作者：葉佳妤/有勁基因

目前用來評估中樞神經系統腫瘤的工具有腦脊髓液細胞學、核磁共振以及腦部活檢；但這些工具都各有其限制性，例如：腦脊髓液細胞學敏感性不足、核磁共振特異性不佳、以及腦部活檢具侵入性等等，因此需要發展出更好的方法去診斷評估患者中樞神經系統的腫瘤。各種嘗試中，有一項被認為甚具潛力的方法，就是以腦脊髓液(Cerebrospinal Fluid; CSF)中的循環腫瘤DNA(Circulating Tumor DNA; ctDNA)當作生物標記去評估中樞神經系統的腫瘤，這個方法簡稱為CSF-ctDNA分析法。不過，這方面的研究目前仍不多，美國德州Shah研究團隊今年發表的期刊論文¹是其中之一；該研究嘗試為中樞神經系統腫瘤的評估尋找更適切的辦法，包括：(1)萃取CSF-ctDNA的最適方法，以及(2)對「CSF-ctDNA內的變異與中樞神經系統腫瘤之間關聯性」進行分析的最佳方法。

Shah團隊在研究中所採用的是Thermo Fisher公司所生產的商業化試劑套組「Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay(泛癌無細胞分析試劑套組)」。從全血血漿中萃取出游離DNA(Cell-Free DNA; cfDNA)後，利用這個試劑套組可以將萃取出來的cfDNA製作成Library DNA(文庫DNA)，然後透過次世代定序(Next Generation Sequencing; NGS)去偵測與分析cfDNA上52個與許多癌症相關的位點突變情形；但研究指出，將此試劑套組應用在中樞神經系統腫瘤患者血漿cfDNA變異偵測與分析上的實際效果並不佳。至於這個試劑套組能否應用在中樞神經系統腫瘤患者的CSF-ctDNA變異偵測與分析，則尚不清楚，因此Shah團隊做了以下測試，以便進行效果評估。

Shah團隊先以10位非中樞神經腫瘤患者的腦脊髓液當對照樣本，使用市面上四種商業化萃取試劑套組來對樣本中的游離DNA進行萃取，以便找出對CSF-cfDNA萃取效果最佳的試劑套組(見圖一A)。這四種試劑套組包括兩組自動化萃取試劑—Qiagen公司的QIAsymphony DSP Circulating DNA (QDSP)和Promega公司的Maxwell RSC System (RSC)，以及兩組手動萃取試劑—Qiagen公司的QIAmp Circulating Nucleic Acid (QCNA)與Thermo Fisher公司的Magmax Cell-free Total Nucleic Acid (MTNA)。比較結果發現，Qiagen的QCNA能萃取到的量最多，Thermo Fisher的MTNA試劑套組萃取到的CSF-cfDNA量最少。

接著，Shah團隊使用萃取效果最好的QCNA試劑套組去萃取38位中樞神經系統腫瘤患者(其中10位為原發性、28位是轉移性腫瘤患者)的CSF-ctDNA；如圖一B所示，萃取時使用愈多的腦脊髓液樣本，可萃取到的CSF-ctDNA就愈多。

圖一、四種DNA萃取試劑套組的CSF-cfDNA萃取結果比較

圖(A)用10個非中樞神經腫瘤患者相同量的腦脊髓液當對照樣本，利用四種不同的試劑套組去萃取樣本中的CSF-cfDNA，看哪個試劑套組萃取效果最好。X軸是四組市售試劑套組，Y軸為CSF-cfDNA的萃取量。平均而言，QCNA可以從1 mL的腦脊髓液中萃取出47.4 ng的CSF-cfDNA；而對相同測試量的腦脊髓液樣本，RSC可以萃取到32.0 ng的CSF-cfDNA，MTNA的萃取量為21.0 ng，QDSP的萃取量則為21.2 ng。圖(B)採用萃取效果最好的QCNA試劑套組去萃取38位中樞神經系統腫瘤患者(其中10位為原發性、28位是轉移性腫瘤患者)的CSF-ctDNA。X軸為腦脊髓液樣本的使用量，Y軸為萃取出的CSF-ctDNA量。腦脊髓液測試樣本量從0.7 mL到4.9 mL，QCNA所得到的CSF-ctDNA萃取量為3.65 ng到3120 ng，由圖可見，腦脊髓液樣本的使用量愈多，萃取出的CSF-ctDNA愈多。(圖片來源：Shah et al. The Journal of Molecular Diagnostics. 2021 Feb;23(2):171-180)

目前已知Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay試劑套組從20 ng「血漿」萃取來的cfDNA，其上的單核苷酸變異(Single Nucleotide Variant; SNV)被偵測極限為0.1% SNVs。Shah團隊想要知道倘若從「腦脊髓液樣本」萃取來的CSF-ctDNA量為20 ng或更低時，是否也能將單核苷酸變異的被偵測極限推至0.1% SNVs？於是Shah團隊利用人工合成的ctDNA去進行評估，結果發現輸入的ctDNA量愈少，被偵測到的變異就愈少。如圖二A所示，當ctDNA輸入量為20 ng時，14個變異可偵測出13個(機率為92.9%)；若ctDNA輸入量為15 ng、10 ng及5 ng時，則只能分別偵測到7個(50.0%)、7個(50.0%)及2個(14.3%)。接著，Shah團隊選擇效果最好的20 ng作為ctDNA輸入量去進行後續DNA文庫的製備，如圖二B所示。文庫製備之後，再分別以100 pMol、50 pMol、30 pMol (註：1 nMol=1000 pMol)三個不同的DNA文庫輸入量去進行次世代定序並做比較；結果顯示，DNA文庫輸入的量越少，能被偵測到的變異就越少。如圖二B所示，DNA文庫輸入量為100 pMol時，14個變異可偵測到13個(機率為92.9%)；DNA文庫輸入量為50 pMol及30 pMol時，則只能分別偵測出11個(78.6%)及7個(50.0%)變異。根據圖二兩項測試的結果發現，採用Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay及次世代定序去偵測分析CSF-ctDNA的變異時，「20 ng的ctDNA搭配100 pMol的DNA文庫」是最適當的濃度條件。

圖二、Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay的ctDNA變異偵測分析表現測試

(A)X軸為14個SNV單核苷酸變異位點，Y軸為突變等位基因頻率(Mutant Allele Frequency; MAF)。不同顏色的長條圖代表不同ctDNA輸入量的變異偵測結果：黑色代表「預期」，為製造商所提供商業cfDNA對照組的偵測結果；紅色、橘色、綠色、藍色則分別標示ctDNA輸入量為20 ng、15 ng、10 ng、5 ng時的偵測結果。(B)不同顏色的長條圖代表不同DNA文庫輸入量的變異偵測結果：黑色代表「預期」，為製造商所提供商業cfDNA對照組的偵測結果；紅色、橘色、綠色則分別標示DNA文庫輸入量為100 pMol、50 pMol、30 pMol時的偵測結果。(圖片來源：Shah et al. The Journal of Molecular Diagnostics. 2021 Feb;23(2):171-180)

再來，根據圖二Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay的表現測試結果，Shah團隊使用Qiagen公司的QCNA試劑套組去萃取來自38位中樞神經系統腫瘤患者(其中10位為原發性、28位是轉移性腫瘤患者)腦脊髓液樣本中的CSF-ctDNA；然後再使用Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay試劑套組，以20 ng的ctDNA輸入量去製備DNA文庫；再以100 pMol的DNA文庫輸入量進行次世代定序。研究對照組的ctDNA是萃取自10位未罹患中樞神經系統腫瘤人士的腦脊髓液樣本。這10位對照組的CSF-ctDNA都沒有偵測到變異；而38位中樞神經系統腫瘤患者中的15位(39.5%)都有至少一個基因位點以上的變異被偵測到；所找到的變異共出現在橫跨8個基因的18個SNV位點上，其中最常見的變異基因是TP53。此外，6位患者的基因CCND1、MYC以及ERBB2也被偵測到拷貝數變異(Copy Number Variation; CNV)，這些SNV以及CNV皆出自轉移性中樞神經系統腫瘤的患者，10位原發性中樞神經系統腫瘤患者則未被偵測到任何SNV及CNV。

最後，Shah團隊先針對8位患者做了「CSF-ctDNA變異基因/位點、與腫瘤組織變異基因/位點」偵測結果是否一致的比較；結果有2位患者的變異偵測結果完全一致，另外6位患者則有部分變異偵測結果一致。Shah團隊再對38位腫瘤受測患者中的34位做了CSF-ctDNA變異偵測分析結果與腦脊髓液細胞學檢測結果的比較，以評估Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay的CSF-ctDNA變異偵測敏感性。結果發現，腦脊髓液細胞學檢測結果為陽性的有10位，其中8位(佔8成)的腦脊髓液也被偵測到有ctDNA的變異；陰性結果有24位，其中6位(佔2成5)在腦脊髓液中有偵測到ctDNA的變異，如圖三所示。

圖三、腦脊髓液的細胞學檢測與ctDNA變異偵測分析法的比較

X軸代表腦脊髓液細胞學的檢測結果，左邊為陽性，右邊為陰性。Y軸為採用Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay試劑套組及次世代定序去進行的CSF-ctDNA變異偵測分析所得到有變異發生的案例數，黑色為有偵測到變異的案例數，白色為未偵測到變異的案例數。(圖片來源：Shah et al. The Journal of Molecular Diagnostics. 2021 Feb;23(2):171-180)

不同發生源的癌症類型採用本篇論文所介紹的方法去偵測基因變異，結果可能不同，這或許與原發性與轉移性中樞神經系統腫瘤的內在生物學因子有關；不過經過Shah團隊的評估，至少可以知道本篇這個CSF-ctDNA分析方法較適用於轉移性中樞神經系統腫瘤患者的基因變異偵測。Shah團隊嘗試了許多不同的實驗條件，並總結出一個最佳化的參考條件；雖然在中樞神經系統腫瘤受測患者中，偵測出變異的機會也只有約4成左右，但在現今診斷方法有限的情況下，仍不失為一項有助益的輔助辦法。

參考文獻

1、Shah et al. Evaluation of the Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay for Analyzing Circulating Tumor DNA in the Cerebrospinal Fluid in Patients with Central Nervous System Malignancies. The Journal of Molecular Diagnostics. 2021 Feb;23(2):171-180. Retrieved from https://www.researchgate.net/publication/348915890_Evaluation_of_the_Oncomine_Pan-Cancer_Cell-Free_Assay_for_Analyzing_Circulating_Tumor_DNA_in_the_Cerebrospinal_Fluid_in_Patients_with_Central_Nervous_System_Malignancies