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作者：尤冠景/有勁基因

單細胞RNA定序(Single cell RNA Sequencing; scRNA-seq)是一種利用高通量定序方法對單一細胞RNA進行擴增與定序的技術，可以幫助微觀、了解和鑑別不同類型的細胞及其基因的表現。單細胞RNA定序的原理是在微流體裝置設置三個通道(如圖一所示)，利用流體技術讓細胞先與裂解緩衝液(Lysis buffer)中鑲嵌著DNA primer的微粒(microparticle)會合；當流經含油的通道時，細胞會被油滴一個個隔開，以一個細胞搭配一個微粒的組合形成各自獨立的微滴(droplet)；隨後微滴內的細胞迅速被裂解緩衝液分解(cell lysis)並釋出mRNA。微粒上所鑲嵌的DNA primer各自標誌了不同的標籤序列(barcode)以及可用來抓取mRNA的Oligo(dT)序列；當微粒抓取完mRNA後就會打破微滴，進行反轉錄與模版交換，然後進入PCR程序。RNA擴增完成之後，每個細胞的RNA library都會包含不同的標籤序列，定序分析時便可透過這些標籤序列去區分每個細胞的RNA表現狀況。詳細過程如圖一所示¹。

圖一、單細胞RNA定序流程圖

(圖片來源：Macosko, E.Z., et al. Cell. 2015 May;161(5):1202-1214.)

近年來，單細胞RNA定序這個技術的發展已經進入成熟階段，為細胞發育與再生醫學、腫瘤微環境、免疫學相關研究、藥物開發、精準醫療等領域帶來重大的突破與發現。今年中國科學院的一個團隊便發表了利用此方法觀察川崎氏病治療前後的免疫反應狀況。

川崎氏病(Kawasaki disease)這種會造成急性全身性發炎的病症好發於5歲以下的兒童；其詳細致病原因至今未明。主要臨床病徵包括發燒、皮疹、結膜炎、口腔黏膜及嘴唇變化、頸部以及四肢出現淋巴結腫大等²。由於該病會引起冠狀動脈炎等嚴重的併發症，是導致兒童後天性心臟病最主要的原因。目前最有效的治療方法是在治療初期靜脈注射單一次高劑量的免疫球蛋白(IVIG)，如此便可盡快退燒，並顯著減少全身性發炎徵狀及冠狀動脈的損傷。然而免疫球蛋白在病人體內是如何作用的，其機制目前仍不清楚；甚至有1至2成的患者對此療法具抗藥性，甚至會因為這樣的治療而讓冠狀動脈疾病的風險提升，因此還需要進一步深入瞭解該病的致病機轉以改善治療方法²。

目前已知川崎氏病是一種和免疫反應有關的疾病，以前的研究大都是以低通量定序去分析免疫系統的細胞類型與轉錄狀態，無法宏觀的看待整個免疫系統的變化，導致有些研究產生互相矛盾的結果。而以往免疫學研究常用流式細胞儀進行細胞分類與基因表現方面的分析，但往往因受限於抗體螢光的相互干擾，能觀察到的基因始終有限。現在有了單細胞RNA定序技術，是否能為該疾病的研究帶來突破性的進展？中國科學院的這個團隊²收集了7位川崎氏病患發病後治療前、以及經IVIG治療並退燒後的周邊血(IVIG治療對所有病患皆有效並沒有出現冠狀動脈炎方面的併發症)，另外還收集了3位健康人的血液作為對照組。圖二是血液樣品的單細胞RNA定序分析結果：相較於健康對照組，川崎氏病患者在治療前血液中單核球(monocyte)以及B細胞(B cell)比例較高，而自然殺手細胞(NK)以及T細胞(T cell)則較低；這個結果與臨床報告相符，可見單細胞RNA定序的確可以幫助鑑識發病時的免疫狀態。

圖二、川崎氏病治療前後的免疫細胞組成

上圖為單細胞RNA定序分析川崎氏病治療前後免疫細胞組成的結果圖示。同類型的免疫細胞以虛線圈在一起，免疫細胞的詳細分類列於右側，以顏色區分。IVIG：靜脈注射人類免疫球蛋白；NK：自然殺手細胞；B：B細胞；T：T細胞；monocyte：單核球。(圖片來源：Wang, Z., et al. Nat Commun. 2021 Sep;12(1):5444-5453.)

發炎症狀有多種免疫細胞參與，會造成發炎的細胞因子，每一種因子有可能是由不同的免疫細胞所分泌。拜單細胞RNA定序所賜，現在不但可以知道免疫細胞在血液中的占比，還可以知道這些免疫細胞的活動狀態。由圖二可知，川崎氏病患者的單核球會大量分泌S100A8、S100A9、S100A12等促發炎因子。高細胞因子症(Hypercytokinemia)是川崎氏病的典型症狀，其診斷指標是IL1B及TNF這兩個細胞因子；由圖三可見，相較於健康人，川崎氏病患者發病時其單核球的這兩種細胞因子分泌顯著提升，治療之後分泌量則下降。

圖三、川崎氏病患者細胞因子在治療前後的分泌情況

左圖為病患治療前各類型免疫細胞的細胞因子分泌情形，圓點越大表示該種免疫細胞(Y軸)有越高的細胞比例表現出X軸上所對應的細胞因子；紫色越深表示該種細胞因子的表現量越大；星號表示相較於健康對照組，該細胞因子的分泌量在統計上有顯著提升。右圖在比較病患治療前、治療後以及健康人的單核球分泌IL1B及TNF這兩種細胞激素的情形。相較於健康人，川崎氏病發病時，患者單核球的IL1B及TNF兩種細胞因子分泌顯著提升，治療之後分泌量則下降。(圖片來源：Wang, Z., et al. Nat Commun. 2021 Sep;12(1):5444-5453.)

單細胞RNA定序有助解決鑑別不同種類細胞的差異，為單一細胞的行為及反應機制等研究提供了新的方向。然而，單細胞RNA定序也有其缺點，例如：定序價格很昂貴，樣本數必然受限，因此統計分析上的效力也會受限；但整體來說，仍是一項強大、有潛力的分析工具。

參考文獻

1、Macosko, E.Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 2015 May;161(5):1202-1214. Retrieved from https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.05.002

2、Wang, Z., et al. Single-cell RNA sequencing of peripheral blood mononuclear cells from acute Kawasaki disease patients. Nature Communications. 2021 Sep;12(1):5444-5453. Retrieved from https://doi.org/10.1038/s41467-021-25771-5