測不準的微生物community @ 有勁的基因資訊

過去，是利用培養的方式來探究環境中微生物的組成，然而，百分之99以上的微生物是無法培養的 (Amann et al., 1995)，因此，80年代發展出非培養的研究方式(cultured independent method)，包含T-RFLP、DGGE、SSCP、以及cloning and sequencing的方式來研究環境微生物的族群 (Nocker et al., 2007)，以上方式，皆是針對族群共有的目標基因的amplicons來分析，目標基因是依據不同的觀察目標而有所差異，常用的基因有18SrRNA (Eukaryotic microbes)、ITS (Eukaryotic microbes)、Bacterial 16S rRNA、Archaea 16S rRNA、與一些功能性的基因 (如 psbA、psaB、amoA與amoB)。T-RFLP、DGGE、SSCP、以及cloning and sequencing四種方式中，以cloning and sequencing的方式能夠提供最精確的資訊 (表一)，然而，在面對高度複雜的環境生態時，必須挑選許多clone去進行定序，才能足以呈現真實的物種組成，例如，至少需要定序1000個clone才能夠呈現沿岸海水的細菌族群圖譜 (Acinas et al., 2004)。

從2006年開始有研究利用目標基因amplicons (如 bacterial V6)，直接進行次代定序，即所謂的Amplicons high throughput sequencing，不但可以免除cloning繁複的流程，而且可以獲得大量的序列資訊 (Sogin et al., 2006)，以Illumia定序技術定序平台為例，一次可以得到超過100,000,000條序列，這種方式同時擁有高輸出量以及高精確度的特性，因此能夠精確地呈現高度複雜的微生物族群圖譜 (表一)。這種amplicons的定序還能夠配合multiplexing(註一)的方式，讓兩種以上來源的樣品同時進行定序，使的定序更加有效率 (Binladen et al., 2007)。這樣的實驗方式已經被廣泛利用，包含人類共生菌的研究 (Huse et al., 2008 and Hummelen et al., 2010)、海水菌相研究 (Anderssonet al., 2010)以及土壤環境研究 (Chu et al., 2010)。

表一

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由表一的比較可以得知，利用PCR的方式放大16S rRNA的基因後，搭配NGS來獲得微生物的community，是目前最有效率的方式，然而，這依然不是完美的方法，主要的問題是 PCR後的序列數量，是否有能夠代表微生物的數量？這至少牽涉到三個因素會影響到準確度，

1、Primer的專一性與PCR偏誤問題

圖一是比對多種微生物的16S rRNA gene，整理出來的序列變化，Sequence Entropy代表序列變異的程度，V1、V2、 V3、 V6 與V7表示變異度高的位置，其他區域是相度變異度較低的區域，常用的”Universal primer”就是設計在這些區域；由圖一可以觀察到，即使在變異度較低的區域依然存在變動性，因此，”Universal primer”必然有些偏好，有可能A物種與B物種16S rRNA gene，放大的效率差異太大，再加上PCR本身的偏誤問題(請參考”都是PCR惹的禍”文章)，造成後續結果的誤判。

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APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2009, p. 3263–3270

2、DNA 萃取效率

不同種類的微生物，其細胞型態也會有所差異，革蘭氏陽性菌與藍綠菌會有相對較厚的細胞壁，造成DNA萃取效率下降，進而造成低估菌的數量。

3、16S rRNA基因數目不同

不同種類的微生物16S rRNA基因數目也不盡相同，即使是同一phylum下，16S rRNA gene copy number也不同，例如Proteobacteria的16S rRNA gene就有2個copy到15個copy不等。因此，即使在PCR完全沒有任何偏誤且DNA萃取的效率皆相同的情況，仍然會有問題存在。

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