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從傳統顯微鏡走向次世代NGS定序 1

傳統的微生物學,源自十七世紀中葉,荷蘭貿易商與科學家〜李文虎克(Antonie Philips van Leeuwenhoek)利用顯微鏡觀察自己口腔的微生物,開啟了微生物科學研究之基礎,後來陸續有科學家建立各式各樣的研究方法,通常都聚焦於少數種類的研究、分離與觀察鑑定等,但地球生物圈中有太多微生物是無法被分離培養研究的,迄今,微生物的研究手段更創新,巧妙的以核酸(DNA/RNA)角度進行微生物的分類。有鑑於此,Handelsman等學者於1998年首先提出『總體基因體學(Metagenomics)』的概念,泛指研究環境某區域的所有微生物,利用特別的標誌基因【如:卡爾•烏斯(Carl Woese)提出的16S rRNA等】進行微生物的種類分析或功能性解讀。歷經傳統Sanger定序,到現在的次世代定序(Next Generation SequencingNGS),總體基因體學的研究效能將更趨極致,NGS定序科技的角色扮演更為舉足輕重。

從傳統顯微鏡走向次世代NGS定序

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什麼是多樣性? 就從微生物當作例子說起吧!

人體的微生物對身體很重要,它們能保護人體健康,調節免疫系統,維護消化系統之運作。2013年興起了腸道環境與疾病相關議題,近期許多期刊上也相繼發表腸道環境(菌相)多樣性與疾病之相關性文獻。2013年6月份《自然Nature》期刊發表一篇文章,提及利用次世代定序儀器分別檢測代謝正常、不正常(血糖控制機能受損)與糖尿病之歐洲女性(平均年齡為70歲)之腸道環境(Gut metagenome)。結果發現,代謝不正常、糖尿病患者之腸道環境與代謝正常之腸道環境非常不同。那些代謝疾病之患者腸道環境改變,雖然腸道內之細菌數量一樣多但多樣性明顯較少。藉此推測,肥胖症、糖尿病與心血管疾病等相關代謝疾病與腸道環境之改變有關連。[1]

同樣地,2013年11月份,《科學Science》期刊發表兩篇[2、3],關於癌症治療效果與腸道環境相關之文章。通常,罹患癌症之患者體力不佳且免疫系統較弱,因此容易受到外環境影響而感染,因此需要藉由抗生素來幫助癌症患者抵抗外環境之感染。但抗生素之使用會影響腸道內菌群發展,而菌群多樣性卻被證實影響著癌症患者接受化療的效果程度。《科學Science》期刊發表兩篇文獻內容皆以動物實驗為模組,結合次世代定序技術檢測腸道環境與癌症之腫瘤微環境的關係,並且指出腸道微生物能夠幫助癌症治療效果。不過,文獻中有提及,這些模組皆作用於動物體上,同時也期望未來在人體試驗上能夠看見署光。

不只腸道環境需要多樣性能夠維持人體健康,人體的免疫系統,同樣也需要多樣性,來維持與調節免疫系統。免疫系統是最了解自體的醫生,當免疫系統發生問題,那麼與免疫相關之疾病當然紛紛出現,因此,若能了解免疫醫生如何診斷與治療人體,那麼疾病也就更容易對付了。早在2009年PNAS[4]文獻發表,利用次世代定序儀器對免疫T細胞接受器( T Cell Receptor,TCR)的特地區域做定序,發現腸癌患者之免疫細胞多樣性比正常人少,免疫細胞的多樣性低及表示功能性較少,即便是免疫細胞總數不變,那麼面對疾病就相對變得難解了。

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 過去,是利用培養的方式來探究環境中微生物的組成,然而,百分之99以上的微生物是無法培養的 (Amann et al., 1995),因此,80年代發展出非培養的研究方式(cultured independent method),包含T-RFLP、DGGE、SSCP、以及cloning and sequencing的方式來研究環境微生物的族群 (Nocker et al., 2007),以上方式,皆是針對族群共有的目標基因的amplicons來分析,目標基因是依據不同的觀察目標而有所差異,常用的基因有18SrRNA (Eukaryotic microbes)、ITS (Eukaryotic microbes)、Bacterial 16S rRNA、Archaea 16S rRNA、與一些功能性的基因 (如 psbA、psaB、amoA與amoB)。T-RFLP、DGGE、SSCP、以及cloning and sequencing四種方式中,以cloning and sequencing的方式能夠提供最精確的資訊 (表一),然而,在面對高度複雜的環境生態時,必須挑選許多clone去進行定序,才能足以呈現真實的物種組成,例如,至少需要定序1000個clone才能夠呈現沿岸海水的細菌族群圖譜 (Acinas et al., 2004)。

從2006年開始有研究利用目標基因amplicons (如 bacterial V6),直接進行次代定序,即所謂的Amplicons high throughput sequencing,不但可以免除cloning繁複的流程,而且可以獲得大量的序列資訊 (Sogin et al., 2006),以Illumia定序技術定序平台為例,一次可以得到超過100,000,000條序列,這種方式同時擁有高輸出量以及高精確度的特性,因此能夠精確地呈現高度複雜的微生物族群圖譜 (表一)。這種amplicons的定序還能夠配合multiplexing(註一)的方式,讓兩種以上來源的樣品同時進行定序,使的定序更加有效率 (Binladen et al., 2007)。這樣的實驗方式已經被廣泛利用,包含人類共生菌的研究 (Huse et al., 2008 and Hummelen et al., 2010)、海水菌相研究 (Anderssonet al., 2010)以及土壤環境研究 (Chu et al., 2010)。


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       想知道某些環境因子的改變(如:生病的腸子或加了料的海水)會使環境中的某群生物(如:細菌或浮游生物)在群聚結構或基因表現有何反應嗎?20122月的PNAS剛好就有篇paper利用metatranscriptome分析Fe2+離子缺乏的海水加料(阿就是Fe2+離子)後,其藻相與基因表現是如何反應的[1]

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 圖1. 紅色與綠色區域為HNLC,位置分別在南大洋、太平洋赤道區域、北太平洋副極區 (http://www.geos.ed.ac.uk/homes/s0675905/MScBSc.html)


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現代人長時間生活在辦公室的空間,工作空間裡潛藏了許多的細菌,與我們朝夕相處的細菌到底有多少?有哪些種類的細菌?這些細菌會致病嗎?辦公室的哪些地方有特別多細菌?男生所處的環境真的比女生擁有更多的細菌嗎?           Hewitt的研究團隊在美國的三個不同城市,隨機挑選九十個辦公室,針對每個辦公室裡的椅子、電話、電腦、滑鼠、鍵盤及桌面約13平方公分面積的區域做細菌採樣,而這些辦公室的使用者分別為男女生各半。首先,作者將樣品稀釋後塗在R2A media的培養基上,經過五天的培養,統計樣品內的菌量,結果如下圖所示,橫軸及縱軸代表的意義分別為樣品的來源及細菌的數量,結果顯示椅子及電話上的菌量高於桌面、鍵盤及滑鼠,另外,男性使用的辦公用品得到的菌量比女性的多,而在不同城市的來源上,舊金山的辦公室菌量是三個城市中最低的,上述的菌量的差異作者使用ANOVA分析的確是有意義的差異性。20120803_pic1  

在菌種分析上,由於環境中的細菌組成複雜,無法以培養方式辨別樣品裡面所有的細菌種類,所以作者先將樣品中的DNA萃取出來,以PCR的方式將16S rRNA基因的高度變異區放大,並且將此產物以NGS技術定序,並且分析這些序列以得到細菌的種類。結果顯示這些辦公室用品附有二十種門中超過五百屬的細菌,其中含量最多的為變形菌門(Proteobacteria),其他比例由高至低依序是厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)擬桿菌門Bacteroidetes,不同樣品細菌種類的相對比例圖如下。

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 與之前做人體各部位菌相的研究相比較2.3.4,辦公室環境中的細菌種類大多也出現在皮膚及口腔,另外特別的是,部分的種類與在人體的消化道內的菌種相同,辦公室細菌種類中,也有些會出現在土壤裡面的細菌,這些結果可以協助推測可能的細菌來源。

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你知道嗎? 細菌族群就棲身在你的身體裡,有些住在皮膚表面,有些居住在腸內道,而不同部位的細菌族群種類也不盡相同,甚至,每個人身體上的菌相也會有所差異;2009年,美國科羅拉多大學團隊,利用NGS系統進行16S rRNA序列分析,進而描繪出全世界第一張人體菌相圖(上圖),讓我們清楚得觀察到,不同部位皆有其獨特的細菌族群,而口腔與腸道是人體菌相最複雜的地方,相較而言,皮膚表面的菌相就顯得單純;有越來越多證據顯示,人類身體的細菌族群與人體健康有關,然而,人體共生菌方面的研究仍在剛起步的階段,這群細菌的所扮演的角色還待更進一步的研究。


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Metagenomics這十年來才發展出來的新學門,主要是透過研究分析環境基因體,進而來描繪環境的代謝特性。

一個完整的環境系統,是由許多種生物組成,這些生物種類包羅萬象,除了肉眼可見的動植物外,還有肉眼看不見的微生物族群,這個族群數量遠比動植物多,包含真核微生物(Eukaryotic microbes)、細菌(Bacteria)、古生菌(Archaea)以及病毒(Virus),然而,百分之99以上的微生物是無法培養的,欲描繪一個真實環境的生化代謝圖譜,最有效的方式就是直接萃取環境中的DNA或RNA加以分析,藉由這些基因體資訊,來對環境有一個全盤性的了解。環境基因體具有高多樣性以及高複雜度,最有名的例子是,Craig Venter從一桶海水中萃取細菌DNA,經過基因體分析後,發現含有150,000,000bp非重複性的鹼基對、1,800個genotype以及1,200,000個過去沒有被記錄過的基因,因此,要描繪出真實的完整的環境基因體特性,需要大量的資料量 (Venter et al., 2004)。為了研究高度複雜的環境基因體,近期發展出兩個學門Metagenomics與Metatranscriptomics;Metagenomics是在DNA的層級,來分析環境基因體;而Metatranscriptomics是以RNA的層級來分析,可以補強Metagenomics不足的部分,除了可以分析各種基因的表現量,還能夠偵測環境中的RNA病毒族群。

早期Metagenomics與Metatranscriptomics實驗流程中,必須將環境的基因體DNA或cDNA轉植到E. coli體內,再進行定序分析,其過程繁瑣而冗長,而且得到的資訊量相對有限 (Trings et al., 2005);現在metagenomics研究,可以跳過繁瑣的分子生物學實驗技術,只需要將環境中的DNA或cDNA,直接進行次代定序(next generation sequencing)。 隨著定序技術的發展,定序資料的輸出量也越來越高,也就能夠呈現基因體真實的樣貌,至2010年,一次NGS定序所能夠得到的資料量已經達到100Gb的等級,因此,面對高度複雜的環境基因體的研究,NGS是最有效率的工具。

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