目前分類:實驗室基因定序方法與技術 (28)

瀏覽方式: 標題列表 簡短摘要

作者:洪郁豪 /有勁生物科技

 

  1948 年,Mandel與Métais首次在人體循環血液中發現含有經細胞代謝產生的游離 DNA (cell-free DNA/cfDNA),其在血漿中所占的含量通常約在1 ng/mL至 10 ng/mL之間。隨後在1977 年,癌症與cfDNA的關聯性研究雖被提出,但相關應用卻是在非侵入性產前檢測領域才有較多重大突破。到了1994年,癌症病人的cfDNA被檢測出腫瘤相關基因的突變型,這些被認為由腫瘤細胞代謝產生的cfDNA突變型,被稱為 ctDNA (circulating tumour DNA);其中KRAS基因為腫瘤相關基因中最常被提出探討的,在過去腫瘤研究上占有舉足輕重的地位。KRAS基因的功能與細胞分裂增生有關,可藉由開啟或關閉功能來調控細胞生長;突變的KRAS基因會打亂細胞正常生長而引發腫瘤。

 

文章標籤

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

作者:劉祥欽 /有勁生物科技

 

全基因組放大 (Whole genome amplification, WGA) 是進行單顆細胞 (或有限的細胞數) 全基因定序時相當重要的步驟。現行單細胞定序的應用有一大部分是在偵測細胞基因組中染色體套數或是小範圍Mb等級的數量變異 (copy number variant, CNV)。具體而言,胚胎著床前基因診斷 (preimplantation genetic diagnosis, PGD)、基於胎兒細胞的NIPT、以及循環腫瘤細胞的液態活檢 (liquid biopsy of circulating tumor cells, CTCs) 等都需要以單細胞定序的技術偵測數量變異。由於這些應用的目標細胞取得的難易程度不一,所需的技術也各不相同,因此今天暫且將這部分的問題放在一邊。取得目標細胞後,如何從中得到足量的DNA會是接下來要思考的問題。一般來說,從一顆細胞取得的DNA只會有picogram等級的量,而製作定序用的library則需要nanogram等級的DNA,所以,必須以WGA的方式將DNA均一的放大。

 

文章標籤

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

作者:吳上豪/有勁生物科技

 

對次世代定序來說,定序重複出現的DNA短片段是一項挑戰。由於基因文庫製作時必須打斷DNA,這過程無法控制DNA斷裂的位置,倘若斷裂後的DNA片段未能包含完整重複的序列,就可能影響定序後的基因體組裝。在此與大家分享一篇利用專一性DNA截切技術—CRISPR/Cas9,在基因文庫製作過程中減少重複序列被從中打斷的機會,藉此提高對重複序列定序能力的研究。

 

文章標籤

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

作者:劉祥欽/有勁生物科技

 

血液中會有一些大小在150~200 bp左右,被稱為cell-free DNA (cfDNA) 的小片段游離DNA,它們是來自於細胞凋亡的過程中尚未被完全降解的殘餘DNA。當身體中有癌症組織不斷增長時,部分癌細胞也會因為免疫系統的對抗而凋亡,進而釋放出一些游離的DNA到血液中 (circulating tumor DNA, ctDNA)組織的癌化常常是因為不斷累積的基因突變所造成的不可逆反應,如果可以辨識出這些可能導致癌化的突變點位,那我們就有機會提早發現癌症與監測治療的效果。

現在,次世代定序 (next generation sequencing, NGS) 為此提供了可能的解方。從大量的cfDNA序列資料中,我們可以從中提取出含有突變點位的序列,但是因為在癌症病程的早期ctDNA所佔的比例通常很低,因此能正確檢測到含量多低的ctDNA會是檢測能否成功的關鍵所在。一般來說,要定出佔2.5%的ctDNA會需要1000倍以上的定序深度。要在特定區域達到這樣的定序深度,可使用hybridization capture或PCR放大的方式來完成。因為有只須少量DNA及實驗流程相對簡單的好處,PCR放大的方法是較被偏好的一種方式。然而在放大過程中,無可避免的會產生一些PCR造成的錯誤 (每個base因為PCR polymerase所造成的錯誤率大約10-6),此外,定序時所導入的錯誤率更高,例如Illumina MiSeq系統會有每個base約0.01到0.1的錯誤機率。低佔比加上高錯誤率大幅提高了辨識變異ctDNA的難度。

文章標籤

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

作者:陳鈺婷/有勁生物科技

 

在定量上,digital PCR (dPCR)real-time PCR (qPCR) 間最大的不同,是digital PCR利用chipdroplet的形式將需要定量的樣品分隔成大量的小分隔,將稀釋的樣品侷限在各分隔中來進行反應,對個別分隔偵測樣品存在與否來決定樣品分子的數量。目前dPCR已被廣泛用於基因序列變異的偵測,如copy number variants或點突變。在分子診斷上,dPCR被應用於癌症學、傳染病學、胎兒基因篩檢及移植排斥反應的預測等。

Rare sequence mutationcopy number數量的偵測為dPCR的優勢;由於dPCR是藉由單一分隔的陰性或陽性訊號來判別,因此不會受限於PCR增幅效應的影響,不需標準曲線來推測分子數目,屬於絕對定量,對於微量樣品的偵測相當有利;但微量定量實驗中,若出現primer設計不良或樣品污染的情形造成false-positive,則會對實驗結果造成極大的誤差。

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

作者:陳崇斌/有勁生物科技

近幾年定序技術的發展迅速,越來越多人使用次世代定序(NGS)進行基因檢測,試圖找尋個體中基因的變異,藉此來了解未來患病的風險或是患病的原因;如何詮釋基因上的變異,是當今最重要的課題之一;由下圖 (Fig. 1)預估的數值,在NGS的費用上,成長最多的有三項,分別是 Biological interpretation、Data Management與Experimental design;反之,定序所佔的比重下降許多,從百分之30下降到百分之5。簡而言之NGS是未來的趨勢,而Biological interpretation (詮釋)、Data Management與Experimental design又是趨勢中的趨勢,很難忽視其重要性。

0712-1.png

Fig 1. NGS 費用所佔比重變化。 Source: Yale University; Frost & Sullivan

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

     Single Molecule Real-Time (SMRT) sequencing發展至今,的確在讀長方面相當優勢 (約 5K-10Kbp),但是在定序價格無法降低的情況下,許多狀況並不合適完全取代次世代定序儀,例如:metagenomics 的定序。近年,10X Genomics 導入這套系統甚至可以產生 50 Kb 組裝後序列,但原理細節對外部並沒有公布,而 Illumina 也增加了一種新的 library 製備方式來獲得近似第三代定序儀讀長的結果,商品名稱為 TruSeq synthetic long read (TSLR) technology。這項技術使用過去 BAC library 這常用來研究物種基因體的觀念,將龐大複雜的基因體切割成許多小部份,只不過每一小部份相較於 BAC,insert 增加至 Kb 以上的單位來做次世代定序。

    目前常見的兩種 Long fragment reads library 製備方式,均不需要真的 cloning放入細菌載體中複製,但會將 Kb 為單位的片段打碎後掛上各自的 barcode,再藉由後端解讀barcode,將定序的資料重新分群後以 Kb 為單位組裝,重現近似第三代定序儀讀長的結果。無庸置疑的,在定序未知物種基因體的 de novo assembly 上相當的有幫助,尤其是能跨越重覆序列 (repeat sequence) 來幫助組裝,除此之外,由於多數物種基因體為多倍型染色體,例如:人類是二倍體 (Diploid) 生物,幾百 base-pair 的讀長有時可能無法正確判斷基因座落在何條同源染色體上,如今,這項技術應用在人類染色單倍體分類 (Haplotyping) 研究,甚至能追溯親代基因型的遺傳。

 

20160406_1.png

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

NGS技術中,降低錯誤率一直是很重要的一個環節。尤其是在癌症領域、法醫鑑定、遠古生物的基因體學、cell free DNA應用、metagenomics應用等領域,目標就是要正確地偵測到頻率很低的變異點位。也因此在實驗方法上如果會造成非特異性的錯誤率太高,就會無法正確的將非常稀有的變異點位找出來,這樣的點位會淹沒在非特異錯誤之中。

在2012年,Quail, M. et al. 曾經測試了當時各種定序平台的錯誤率,在當時,illumina 定序平台之隨機錯誤率基準值在0.1~0.5% 之間,而其他定序平台則在>1%。然而經過3年的時間,各家定序平台都推出了新版本的反應試劑,像是Ion Torrent 系統推出了Hi-Q定序試劑,Illumina 系統推出了SBS kit V2。這些定序試劑藉由更改化學配方與反應酵素,嘗試著降低各種可能的錯誤。在2015年,尚未有看到詳盡的新版本評比資訊,但隨著不同廠商不同機種的持續推出,可以期待未來在定序機台本身會有更好的表現。

 

High fidelity PCR enzyme

文章標籤

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

在2013年底,Nature Method 期刊將單細胞定序選為年度技術。在發育生物學、腫瘤基因體學、生殖醫學等領域,單細胞定序技術已經開始發揮它的威力,為我們帶來許多珍貴的訊息。本篇主要著重於此技術在當前的現況,介紹目前的單細胞分離技術、放大技術、與一些應用的面向。第一部分將先介紹技術的部份,第二部分將整理一些已發表的應用情形。

單細胞定序的流程,大概可分為1. 單細胞分離,2.依照不同的需求放大樣本進行定序。可以參考圖一。

20140527_1  

 圖一 單細胞定序的流程(圖片來源: Single-cell sequencing Vol.11 No.1 | JAN 2014 |Nature Methods)

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

在Ion torrent 定序平台中,要定序之前,要先做出成功的 emulsion PCR,才有可能有好的定序品質 , 但首先要克服以下情況:

        1.  Micro-reactor 必須有一致的大小 :

emulsion PCR 是利用油滴包覆Emulsion PCR 必須所含的物質,包含Bead、 一條 DNA template、d NTP、DNA polymerase、co-factor 等等。這樣的一個反應油滴我們稱之為 micro-reactor。一般而言,micro-reactor 的大小約在 20-30 um , 這樣的大小已經足以提供 Emulsion PCR 一個很好的反應環境。 micro-reactor 若是太大,就會容易造成 polyclonal 的形成 ( 即一個micro-reactor 裡面含有兩條不同的 DNA template,使同一個bead上會有兩種不同序列的 template,造成定序時判讀微弱或混亂 )。

micro-reactor 也不能太小,太小的反應空間雖然可以減少 polyclonal 的形成,卻會使一些emulsion PCR 所需的 co-factor 無法存在於micro-reactor 中,使的Emulsion PCR效率減低。

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

實驗上,我們時常使用 Polymerase Chain Reaction (PCR) 這項技術增幅目標核酸片段,這在建構NGS gDNA 或cDNA library時亦是其中重要的一環,然而實際上,進行 PCR 會因為兩種現象而機率性地產生非預期的結果:第一、在增幅過程中,片段小的 template 會傾向較容易地被放大;第二、經 PCR產生的產物有部分序列相似時,它們會在 annealing 的步驟中發生部份的雜合配對,而在extension 的步驟被 polymerase 延長,進而產生 chimeric副產物。此外,PCR 的過程中有時會伴隨 primer extension 不完整的產物產生,這樣的產物會在前述的部分配對中,在下一個 PCR cycle 繼續的被延長,但產生大小不一的 chimeric副產物。眾多的 PCR protocol 考量到上述現象,會適當地調整步驟,例如:提高 DNA模板的濃度或是降低 PCR 的 cycle 數,然而,當面對模板 DNA 極微量的情況時,就很難避免 PCR cycle 數的增加,而提高 chimera 出現的風險 (圖一、左)。

針對上述傳統 PCR 的弱點,新式的 PCR 方式被開發出現,利用油水不互溶的特性,製作出許多微小的水滴散布在油類溶液環境中,各種序列不同的模板 DNA 分子被隔離分開至各水滴中,每個水滴均為水性緩衝溶液並包含 PCR 過程所需的材料:DNA polymerase、primer、dNTPs,在適當的比例調配下,每個微小的水滴可少至僅含一條模板DNA 分子,使得每個水滴中的 PCR 反應互相不影響,只會忠實的放大同一條模板分子,所有的 PCR 產物平均地生合成且不會再因部分配對的雜合而被錯誤放大,PCR 反應材料不需競爭、也不因酵素催化的喜好性而出現偏向,徹底解決前述傳統 PCR 的問題 (圖一、右)。

20140317_pic1

 

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

在實驗過程中多多少少會遇到一些問題,例如有兩個分別貼上DNA及RNA標籤的樣品,在實驗過程中標籤都掉了此時該如何分辨?

也許分辨的方法不只一種,但其中一種是可以利用溶液PH值的酸鹼來辨別,首先將兩管樣品分別取出一些加入鹼性溶液中,再去跑膠則就可以判斷出哪一個為RNA。

RNA在鹼性環境下會有不穩定的現象,甚至會產生降解的情況,其原因是RNA 2號碳上的OH基會受到鹼性溶液(OH-)攻擊,而則造成phosphodiester bond 遭破壞而斷裂行成2’,3’-cyclic monophosphate derivative(如下圖),所以在分子生物中PH值是很重要的介面之一。

20140107_pic1  

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

RNA 樣品製備 NGS 定序上機的前端作業方面,Illumina 所採用的方式是使用 Oligo-dT 來篩選出帶有 PolyA tailmRNA,然而這種方式面對品質較差的 RNA 時,將會受到限制,並且一些不帶有 PolyA tailmRNA,將無法被觀察到,因此有其他廠商使用其它的策略發展新的製備方式,如:NuGEN Ovation,它可以使用少至 500 pgRNA 來完成 library,並且即使 RNA 品質較差,依然可以適用。

 20131023_pic1

圖一、 NuGEN 開發Ribo-SPIA 技術轉成雙股 cDNA

 

文章標籤

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

在現今科技進步的社會中,NGS除了扮演尋找SNP與mutation或是de novo sequencing…等等也讓科學家縮短了研究各式各樣基因圖譜的時間。但很遺憾的是目前NGS的前置作業也就是製備library的方法,並沒有可以完完全全代替人力的自動化系統來完成library,因此為了彌補這項缺失Hanyoup Kim,et al.等人開發針對illumina定序平台的自動化library製備系統,此系統稱為microfluidic system,這套系統結合了droplet-based digital microfluidic (DMF),所以library製備可以在此系統完成。(如下圖)

20130913_pic1 

a. 指microfluidic system,而右上角長條狀的圖示則表是DMF-capillary interface。

b. 左邊圖示原理圖,右邊則是利用microfluidic方法製備DNA library的說明圖。

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

    隨著 NGS 技術演進,這項越來越成熟的技術慢慢促進許多領域的發展及快速成長,包括人類發展學、基因表現及調控、基因變異學及年齡與衰老相關研究等,未來更有可能影響醫藥、健康看護、疾病預防及臨床醫藥治療等領域發展。

    樣品製備成 library 提供 NGS 上機在這項技術占有很重要的地位,目前在操作 whole genomic DNA library 時,首先需要面對的問題是如何將 genomic DNA 片段化至適當的大小,並且必須盡可能使斷點隨機及減小 DNA 受損程度。目前常見的方式是使用物理性的超音波震碎,例如:CovarisBiorupter,或是使用液態壓力將分子截斷,例如:Hydroshear,除此之外,尚有使用特殊酵素 (fragmentase) 切斷 DNA 的方式及 transposon 插斷 DNA 的方式。

   微波爐加熱應用在實驗室工作上並不少見,它被使用在促進細胞裂解、加速化學反應,微波爐的放射線被應用在增加酵素裂解蛋白質反應速度,然而應用在處理核酸裂解方面目前則從未被實驗過,若能控制得並再現性高,想必可以同時擁有減少實驗時間及同時處理大量樣品兩項優點。

   微波爐的DNA 的片段化實驗以以下方式來進行,調整不同溫度及時間測試 genomic DNA 的變化,而常見的 Covaris 超音波震碎法以及較少見的高溫處理法被用來當作此項實驗的對照組,處理後以洋菜膠體電泳方式確認 DNA 分子大小分布。隨後,依照 Roche 454 library 製備標準流程建構 library,在 ligation 後的產物,使用 Bio-Rad real-time PCR 試劑分析並且同時放大總量,純化後再以 Agilent 2100 bioanalyzer 自動電泳觀察 library 分子量大小,最後以 Roche 454 pyrosequencing 系統上機定序及後續軟體分析數據。

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

20130531_pic1  

急性骨髓性白血症 Acute myeloid leukemia (AML) 通常是由於體細胞的基因突變所造成,尤其是早期進行造血作用 (hematopoiesis)stem cellmyeloid progenitor cell。而 FLT3  這個 receptor的異常在 AML 的形成中扮演著重要腳色,尤其是含有FLT3 ITD (Fms-like Tyrosine Kinase-3 Internal Tandem Duplication)的病例在AML 中所佔的比例約有 20-30% 的高比例,其餘則是 point mutation 所造成的基因異常,例如在 D835

FLT3 基因在早期的造血細胞才會有比較高的表現量,它的位置在 13q12.2,含有 24exonORF2979 bps。而 FLT3 ITD是在其 juxtamembane domain 的位置有片段大小不一的 insertion (約在 exon 1415 之間) ,長度大約在 15-300不等。FLT3 ITD 會使的FLT3 在沒有 ligand 的情況下持續被活化,讓下游的PI3KRAS pathway 處於一個異常的狀態。FLT3的持續活化會造成細胞增生 (cell proliferation) 以及抑制細胞凋亡 (apoptosis),這也是血癌形成的主因。

 

文章標籤

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

隨著NGS次代定序的技術不斷的推陳出新,其能力所涵蓋的層面亦越來越豐富,但一套完整的NGS,其構成的條件,不單只有最新的定序儀器就足夠,定序核酸樣品的良劣往往左右最後定序結果,所謂工欲善其事,必先利其器,要怎麼收穫就要先怎麼栽的道理。本篇文章主要淺談游離核酸(Cell-Free nucleic acids) 的品質對於NGS定序之重要性。在醫學方面,以游離核酸的研究漸趨深入,其為一種細胞外呈游離狀態的小片段核酸,存在於血液、尿液與唾液等,大部分可經由三種方式:細胞凋亡(apoptosis)、細胞壞死(necrosis)與胞泌作用(secretion)進行胞外釋放(圖一),其中又以游離DNA (Cell-Free DNAcfDNA) 應用於癌症腫瘤監控及胎兒產前的診斷(圖二)之進展最為豐富。

20130426_pic1    

圖一

 

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

    自從 NGS 技術發展至今,已有無數的古老生物被進行定序,這些生物樣品可能來自數千年以前。為了進行定序,首先需要將這些受損或降解的 DNA 片段製備成可供 NGS 定序儀上機使用的 library,而製備的目的主要是讓 DNA 片段兩端接上人工合成的 adapter,一則可起始定序反應,一則可用作 PCR 增輻反應。目前製備的主流方式分為兩種:一種是 454 Life science 使用的 blund end ligation;另一種是 Illumina 使用 Y 型結構的 adapter 進行 A-T ligating,不論何種方式,均為雙股 DNA 的黏合反應,然而,在操作古老 DNA 時,這種製備流程可能會發生一些缺憾。

 

使用新的單股 DNA 來製備 NGS library,比較目前常見的方式具有以下的優點:

第一、製備過程中 DNA 標示上 biotin,因此純化的步驟使用 streptavidin-coated的磁珠,能減少樣品流失。

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

人類乳突病毒Human Papilloma virus(HPV)是一種分子較小直徑約55nm的DNA病毒,目前人類乳突病毒有一百多種基因型,不同基因型的人類乳突病毒引起的疾病種類不盡相同,其中以30~40種類型的人類乳突病毒會透過性行為傳染到生殖器或周邊皮膚,而這些種類當中又以10~15種最容易引起子宮頸癌與其他生殖道癌,例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68

被稱為高危險性病毒。人類乳突病毒除了導致大家所熟悉的子宮頸癌之外,在流行病學與分子生物學研究報告中顯示人類乳突病毒也可能造成頭頸癌的發生。

 

加拿大知名生物學家在Human Papilloma virus研究中

文章標籤

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

在哺乳動物,DNA 甲基化通常發生在CpG dinucleotides 上,而且是研究基因調控和疾病誘發重要的epigenetic mark 。詳細的了解 DNA 甲基化程度和位置對於研究發育 (development) 和疾病型態 (disease phenotype) 有很大的幫助,尤其以癌症來說,甲基化的研究可以提供診斷的 biomarker。在哺乳動物的DNA大約有~1 % 的 5’-methylcytosine (5MeC), 其中這甲基化有70~80% 位於CpG dinucleotides。但是DNA methylation pattern 在每一個個體或是組織會有所不同,是處於一種動態的模式,這樣的情況讓基因的定序常常有偏差的情況發生。

  近年發展了三種研究 DNA 甲基化的主要方法:

1. Chemical conversion with sodium bisulfite

2. Digestion with methylation-sensitive restriction enzymes

文章標籤

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()

1 2

您尚未登入,將以訪客身份留言。亦可以上方服務帳號登入留言

請輸入暱稱 ( 最多顯示 6 個中文字元 )

請輸入標題 ( 最多顯示 9 個中文字元 )

請輸入內容 ( 最多 140 個中文字元 )

請輸入左方認證碼:

看不懂,換張圖

請輸入驗證碼