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在Ion torrent 定序平台中,要定序之前,要先做出成功的 emulsion PCR,才有可能有好的定序品質 , 但首先要克服以下情況:

        1.  Micro-reactor 必須有一致的大小 :

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實驗上,我們時常使用 Polymerase Chain Reaction (PCR) 這項技術增幅目標核酸片段,這在建構NGS gDNA 或cDNA library時亦是其中重要的一環,然而實際上,進行 PCR 會因為兩種現象而機率性地產生非預期的結果:第一、在增幅過程中,片段小的 template 會傾向較容易地被放大;第二、經 PCR產生的產物有部分序列相似時,它們會在 annealing 的步驟中發生部份的雜合配對,而在extension 的步驟被 polymerase 延長,進而產生 chimeric副產物。此外,PCR 的過程中有時會伴隨 primer extension 不完整的產物產生,這樣的產物會在前述的部分配對中,在下一個 PCR cycle 繼續的被延長,但產生大小不一的 chimeric副產物。眾多的 PCR protocol 考量到上述現象,會適當地調整步驟,例如:提高 DNA模板的濃度或是降低 PCR 的 cycle 數,然而,當面對模板 DNA 極微量的情況時,就很難避免 PCR cycle 數的增加,而提高 chimera 出現的風險 (圖一、左)。

針對上述傳統 PCR 的弱點,新式的 PCR 方式被開發出現,利用油水不互溶的特性,製作出許多微小的水滴散布在油類溶液環境中,各種序列不同的模板 DNA 分子被隔離分開至各水滴中,每個水滴均為水性緩衝溶液並包含 PCR 過程所需的材料:DNA polymerase、primer、dNTPs,在適當的比例調配下,每個微小的水滴可少至僅含一條模板DNA 分子,使得每個水滴中的 PCR 反應互相不影響,只會忠實的放大同一條模板分子,所有的 PCR 產物平均地生合成且不會再因部分配對的雜合而被錯誤放大,PCR 反應材料不需競爭、也不因酵素催化的喜好性而出現偏向,徹底解決前述傳統 PCR 的問題 (圖一、右)。

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在實驗過程中多多少少會遇到一些問題,例如有兩個分別貼上DNA及RNA標籤的樣品,在實驗過程中標籤都掉了此時該如何分辨?

也許分辨的方法不只一種,但其中一種是可以利用溶液PH值的酸鹼來辨別,首先將兩管樣品分別取出一些加入鹼性溶液中,再去跑膠則就可以判斷出哪一個為RNA。

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RNA 樣品製備 NGS 定序上機的前端作業方面,Illumina 所採用的方式是使用 Oligo-dT 來篩選出帶有 PolyA tailmRNA,然而這種方式面對品質較差的 RNA 時,將會受到限制,並且一些不帶有 PolyA tailmRNA,將無法被觀察到,因此有其他廠商使用其它的策略發展新的製備方式,如:NuGEN Ovation,它可以使用少至 500 pgRNA 來完成 library,並且即使 RNA 品質較差,依然可以適用。

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火星一直被許多人討論可能會在數十億年前有生命體的存在,甚至上火星的探勘器有發現疑似是水的流路或冰河痕跡,所以更有科學家大膽推測地球上的生命是源自火星。當然這些討論及假設目前並沒有確切證據可以證實,但回歸到地球生命的本質,DNA及RNA架構了生命體,所以找尋火星上是否有DNA或RNA的存在,並且進一步定序,可提供科學家許多的資訊來找尋生命的蹤跡及推斷生命的起源。若直接由火星採集樣品再回地球執行定序,在時間上會非常耗時(來回火星及地球就要耗費數年),除此之外,DNA及RNA也有可能在運送過程中降解,所以研究人員希望能夠直接在火星上執行定序,稱之為in situ Life Detection,如此可立刻知道定序的結果,若有問題亦能立即再採樣。

        麻省理工學院Christopher E. Carr研究團隊提出使用次世代定序系統執行in situ Life Detection任務的概念,並且認為相對較為單純的無光學系統半導體定序技術是較為適合的平台,然而在外太空輻射線充斥的環境下,可能會對於定序過程有所影響,因此,他們將Ion torrent的314 chip處理各式各樣強度及種類不一的輻射(Fe-56, O-18, H-1),並進一步分析其產生的影響,實驗設計如下表所示,總共40片的chip,其中20片用電子的方式測試輻射照射前及後的影響,另外20片經輻射照射後,直接拿來定序E. coli的DNA,並且分析定序結果。

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在現今科技進步的社會中,NGS除了扮演尋找SNP與mutation或是de novo sequencing…等等也讓科學家縮短了研究各式各樣基因圖譜的時間。但很遺憾的是目前NGS的前置作業也就是製備library的方法,並沒有可以完完全全代替人力的自動化系統來完成library,因此為了彌補這項缺失Hanyoup Kim,et al.等人開發針對illumina定序平台的自動化library製備系統,此系統稱為microfluidic system,這套系統結合了droplet-based digital microfluidic (DMF),所以library製備可以在此系統完成。(如下圖)

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    隨著 NGS 技術演進,這項越來越成熟的技術慢慢促進許多領域的發展及快速成長,包括人類發展學、基因表現及調控、基因變異學及年齡與衰老相關研究等,未來更有可能影響醫藥、健康看護、疾病預防及臨床醫藥治療等領域發展。

    樣品製備成 library 提供 NGS 上機在這項技術占有很重要的地位,目前在操作 whole genomic DNA library 時,首先需要面對的問題是如何將 genomic DNA 片段化至適當的大小,並且必須盡可能使斷點隨機及減小 DNA 受損程度。目前常見的方式是使用物理性的超音波震碎,例如:CovarisBiorupter,或是使用液態壓力將分子截斷,例如:Hydroshear,除此之外,尚有使用特殊酵素 (fragmentase) 切斷 DNA 的方式及 transposon 插斷 DNA 的方式。

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人類乳突病毒Human Papilloma virus(HPV)是一種分子較小直徑約55nm的DNA病毒,目前人類乳突病毒有一百多種基因型,不同基因型的人類乳突病毒引起的疾病種類不盡相同,其中以30~40種類型的人類乳突病毒會透過性行為傳染到生殖器或周邊皮膚,而這些種類當中又以10~15種最容易引起子宮頸癌與其他生殖道癌,例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68

被稱為高危險性病毒。人類乳突病毒除了導致大家所熟悉的子宮頸癌之外,在流行病學與分子生物學研究報告中顯示人類乳突病毒也可能造成頭頸癌的發生。

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       真核生物的genome size較原核生物大,且有許多條大小不一的染色體,所以在進行optical mapping及定序資料的組裝上較為困難。若能將真核生物的每個染色體獨立的分離出來,再分別進行定序或解出restriction enzyme map,對序列組裝上會有相當大的幫助。

將不同大小型態的染色體分離出來的技術一直以來都有許多研究團隊在開發,其中的技術包含使用micromanipulator配合雷射切割、使用原子力顯微鏡atomic force microscope nanolithography及流式細胞儀Flow cytometry,其中流式細胞儀Flow cytometry是被認為分離效果較佳的技術。

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DNA Genotek® OrageneˑDNA ( OG-500 )DNA Collection Kit在臨床上的應用

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科學家們發現在不同環境發現的古生物化石 DNA,其受損降解的情形其實是很類似的,使用次代定序的平臺研究古代 DNA 能夠直接的檢測許多現象,為人熟知的例如:嘌呤丟失作用 (Depurination)、胞嘧啶的去胺基作用(Cytosine deamiation)fragmentation rate……等等。

   圖一是研究人員將始祖馬的次代定序所獲得的讀序,比對回現代馬基因體後所做的統計分析結果,觀察發現古生物 DNA 時常斷裂在嘌呤 (GuanineAdenosine) 的後方 (Y 軸標示 -1 位置),也因此讀序的第一個鹼基 (Y 軸標示 +1 位置) 有較高的機率出現嘧啶 (CytosineThymine ),這一項證據似乎可以證明嘌呤丟失作用 (Depurination) 對於 DNA 斷裂降解的影響。

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之前我們在”跨越定序平台的迷思”一文中提到,同一個library在Illumina的兩個不同定序機台 (Miseq 及 Hiseq2000) 定序的結果並沒有特別的差異。然而,同一樣品在不同 library 製備方法下,會產生出不同的定序結果嗎?

        2012 年 Joern Toedling 的研究團隊以 small RNA sequencing 做了一系列相關的研究,其將老鼠的 ES_XX (embryonic stem cell line female) 及 ES_XY (embryonic stem cell line male) 做為比較的對象,以不同平台的 small RNA library 的製備法處理樣品,並且分析其定序資料,不同製備法配合樣品的資訊如下表。

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即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction,簡稱為Real-time PCR),又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應(Quantitative real time polymerase chain reaction,簡稱為Q-PCR)。Q-PCR是藉由PCR擴增原理將DNA放大的同時並達到即時定量之結果,若使用傳統PCR方法來定量的話是較費時費工又容易汙染,因此Q-PCR已經廣泛使用在定量這方面。

 

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Library construction過程中,DNA及RNA濃度的精準測定是相當重要的。尤其在製備library之前,必須要了解樣品的濃度,才能取出適當總量的DNA或RNA做為製備的原料,若因為濃度偵測的不準確,會導致最後library產物總量不足夠上機定序。目前常見的DNA及RNA濃度測定方法有吸光值測定法、專一性螢光染劑測定法。

 

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PCR-Free 顧名思義是指不經 PCR 步驟而完成 library construction。

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