目前分類:實驗室基因定序方法與技術 (19)

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作者:陳正鑫/有勁生物科技

 

NIPT是一種以非侵入的方式檢測孕婦血液中的游離DNA,該DNA的來源主要為媽媽本身,但亦有胎兒在發育中進行細胞凋亡所殘留的DNA。胎兒DNA占全部游離DNA的比例是左右NIPT準確率以及可信度的關鍵,一般認為,當胎兒比例低於4%時,因為僅能偵測到有限的胎兒DNA數量,將會導致NIPT出現偽陰性的結果,所以將胎兒DNA比例做為NIPT的品質管理條件是很重要的,至今,有許多實驗室運用不同的生物資訊手段發展出許多推估胎兒DNA比例的計算方法。

 

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作者:劉祥欽/有勁生物科技

血液中會有一些大小在150~200 bp左右,被稱為cell-free DNA (cfDNA) 的小片段游離DNA,它們是來自於細胞凋亡的過程中尚未被完全降解的殘餘DNA。當身體中有癌症組織不斷增長時,部分癌細胞也會因為免疫系統的對抗而凋亡,進而釋放出一些游離的DNA到血液中 (circulating tumor DNA, ctDNA)組織的癌化常常是因為不斷累積的基因突變所造成的不可逆反應,如果可以辨識出這些可能導致癌化的突變點位,那我們就有機會提早發現癌症與監測治療的效果。

現在,次世代定序 (next generation sequencing, NGS) 為此提供了可能的解方。從大量的cfDNA序列資料中,我們可以從中提取出含有突變點位的序列,但是因為在癌症病程的早期ctDNA所佔的比例通常很低,因此能正確檢測到含量多低的ctDNA會是檢測能否成功的關鍵所在。一般來說,要定出佔2.5%的ctDNA會需要1000倍以上的定序深度。要在特定區域達到這樣的定序深度,可使用hybridization capture或PCR放大的方式來完成。因為有只須少量DNA及實驗流程相對簡單的好處,PCR放大的方法是較被偏好的一種方式。然而在放大過程中,無可避免的會產生一些PCR造成的錯誤 (每個base因為PCR polymerase所造成的錯誤率大約10-6),此外,定序時所導入的錯誤率更高,例如Illumina MiSeq系統會有每個base約0.01到0.1的錯誤機率。低佔比加上高錯誤率大幅提高了辨識變異ctDNA的難度。

為了解決這樣的問題,每一條DNA在被放大之前就要加上一段可供辨識與複製,被稱為分子條碼 (molecular barcode)的獨特序列,如此, 因為PCR或定序而產生的錯誤就可以被辨識與排除,而計算分子條碼的數量亦可估計出偏差較少的變異ctDNA比例。目前,市面上已經有一些可以用來製備定序用DNA文庫 (library) 的產品,但導入分子條碼的產品屈指可數,其中,QIAGEN的QIAseq™ targeted DNA panel是一個可使用在Ion Torrent或Illumina這兩個主流系統的產品。它在製備library時,會先將帶有分子條碼的adapter接上任意cfDNA的5’端位置,如此每一條cfDNA皆會有自己的一組分子條碼,附帶一提,這個分子條碼由12個任意鹼基對組成,因此可標記412 (16,777,216) 條cfDNA。接好後,再用設計好針對欲定序區域特定序列的引子與針對adapter上固定序列的引子用PCR放大,最後,再用一組universal primer導入sample index及進一步放大以供定序 (https://goo.gl/771N8Z, 圖一)。

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類風濕性關節炎全球盛行率0.5%,係屬自體免疫性疾病,自體免疫攻擊體內的組織,造成發炎及破壞關節滑膜。ACPA (Anti-citrullinated protein autoantibody)為類風濕關節炎的特異性生化指標,常做為診斷及判斷疾病嚴重程度的依據。

主要組織相容性複合物 (major histocompatibility complex, MHC)於人體稱為人類白血球抗原 (human leukocyte antigen, HLA),位於染色體6p21,分成兩大類(1) class I包括HLA-A、HLA-B、HLA-C;(2)Class II包括HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR。MHC的功能為結合並呈現抗原胜肽,活化T細胞的免疫反應,具多樣性抗原呈現。而類風濕性關節炎的遺傳性約30%–50% ,尤其HLA-DRB1。

Yukinori Okada等學者在2016年發表於The American Journal of Human Genetics的研究,針對日本族群進行大規模類風濕關節炎MHC的研究,主要是透過HLA imputation及fine mapping去分析MHC complex基因上的變異情況,共有6,244 RA cases及 23,731 controls。接著進行多種族驗證研究,包括東亞和歐洲人口 (分別n = 7,097和23,149)。本次研究中依據RA及血液ACPA檢驗結果進行分組,分組如下(1) ACPA-positive RA cases (2)ACPA-negative RA cases (3) controls。相較於先前GWAS 的研究,最大的發現是在cis-eQTL分析下證明HLA-DOA (非典型的HLA基因)的同義突變 (synonymous mutation)與ACPA-positive RA risk有關。多種族驗證研究中,發現HLA-DOA 和HLA-DRB1有不同的連鎖不平衡模式,說明了不同人種間HLA-DOA 變異風險為異質性。


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SRL 國際交流  

印度人口數量名列全球第二多,以人為主要服務對象的醫學檢驗機構,在該國所扮演的角色更顯得舉足輕重。『SRL Diagnostic 』是印度重要且知名之醫學檢驗機構,此行前往SRL Diagnostic 公司,主要為交流「非侵入性產前胎兒染色體基因檢測(Non-Invasive Fetal Trisomy TestNIFTYNon-Invasive Prenatal TestNIPT)」的相關實驗技術指導。NIPT這個新的產前檢查技術,自香港中文大學盧煜明教授發表並開始推行之後,近幾年正迅速的席捲全世界的婦產醫學領域,其普及程度逐漸涵蓋許多先進國家,關於NIPT這方面的實驗研發與生物資訊分析,台灣有勁生技起步得早,業已累積超過數以萬計的分析個案,有豐富的專業經驗做堅強後盾,並於產前基因檢測等生技市場上,佔有一席之地。

有鑑於此,印度SRL Diagnostic  醫檢機構,雀屏中選『台灣有勁生技』,希望本公司能夠前往指導相關NIPT的實驗技術,由於印度人口眾多,關於婦產醫學的產前檢測市場,更是有許多未開發的廣大潛力。此行交流主要以Ion Proton™ System 的次世代定序平台為主,將NIPT整套實驗流程,從血漿中游離DNA之萃取(Plasma DNA extraction)、樣品製備(Library construction)、樣品品管濃度檢測(qPCR)、定序之前--後流程(OT2-ES-Sequencing)、及生物資訊分析,進行實驗操作教學與經驗分享。

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現今電腦科技的突飛猛進,早已跳脫摩根定律。2001年大導演史蒂芬史匹柏所執導的電影「AI人工智慧」,乃至於2004年威爾史密斯所主演的「機械公敵」,都是以智慧型機器取代工業與生活所需,工作面貌則呈現來勢洶洶的機器大軍。從法國工業革命到現代的產業革命,從半自動的設備躍升為智慧型的自動化儀器,機器始終扮演重要的角色。次世代定序科技(Next Generation SequencingNGS)的實驗操作,在智慧型機器化的氛圍薰陶下,也催生了全自動化實驗操作設備,本公司因應時代創新潮流,更是引進這套全自動的實驗系統『Ion Chef System』,這台儀器好比一台五星級的主廚快餐車,定序DNA樣品都可經由 Ion Chef 自動化的流程,進而完成定序前的處理作業,讓定序實驗的安排流程更有效率,品質更為一致性,亦省去人為實驗的時間束縛。機器人時代來臨,就投資角度而言,取代傳統人力,的確有助於企業長期獲利及產品穩定品管,這是未來勢在必行的方向,或許會發生不可預知影響,也可能會產生大量的取代事件,未來改變只會更快速,或許顛覆現在所想像,僅管如此,我們依然要充分準備好迎接智慧機器次時代的來臨。  

 

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在Ion torrent 定序平台中,要定序之前,要先做出成功的 emulsion PCR,才有可能有好的定序品質 , 但首先要克服以下情況:

        1.  Micro-reactor 必須有一致的大小 :

emulsion PCR 是利用油滴包覆Emulsion PCR 必須所含的物質,包含Bead、 一條 DNA template、d NTP、DNA polymerase、co-factor 等等。這樣的一個反應油滴我們稱之為 micro-reactor。一般而言,micro-reactor 的大小約在 20-30 um , 這樣的大小已經足以提供 Emulsion PCR 一個很好的反應環境。 micro-reactor 若是太大,就會容易造成 polyclonal 的形成 ( 即一個micro-reactor 裡面含有兩條不同的 DNA template,使同一個bead上會有兩種不同序列的 template,造成定序時判讀微弱或混亂 )。

micro-reactor 也不能太小,太小的反應空間雖然可以減少 polyclonal 的形成,卻會使一些emulsion PCR 所需的 co-factor 無法存在於micro-reactor 中,使的Emulsion PCR效率減低。

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實驗上,我們時常使用 Polymerase Chain Reaction (PCR) 這項技術增幅目標核酸片段,這在建構NGS gDNA 或cDNA library時亦是其中重要的一環,然而實際上,進行 PCR 會因為兩種現象而機率性地產生非預期的結果:第一、在增幅過程中,片段小的 template 會傾向較容易地被放大;第二、經 PCR產生的產物有部分序列相似時,它們會在 annealing 的步驟中發生部份的雜合配對,而在extension 的步驟被 polymerase 延長,進而產生 chimeric副產物。此外,PCR 的過程中有時會伴隨 primer extension 不完整的產物產生,這樣的產物會在前述的部分配對中,在下一個 PCR cycle 繼續的被延長,但產生大小不一的 chimeric副產物。眾多的 PCR protocol 考量到上述現象,會適當地調整步驟,例如:提高 DNA模板的濃度或是降低 PCR 的 cycle 數,然而,當面對模板 DNA 極微量的情況時,就很難避免 PCR cycle 數的增加,而提高 chimera 出現的風險 (圖一、左)。

針對上述傳統 PCR 的弱點,新式的 PCR 方式被開發出現,利用油水不互溶的特性,製作出許多微小的水滴散布在油類溶液環境中,各種序列不同的模板 DNA 分子被隔離分開至各水滴中,每個水滴均為水性緩衝溶液並包含 PCR 過程所需的材料:DNA polymerase、primer、dNTPs,在適當的比例調配下,每個微小的水滴可少至僅含一條模板DNA 分子,使得每個水滴中的 PCR 反應互相不影響,只會忠實的放大同一條模板分子,所有的 PCR 產物平均地生合成且不會再因部分配對的雜合而被錯誤放大,PCR 反應材料不需競爭、也不因酵素催化的喜好性而出現偏向,徹底解決前述傳統 PCR 的問題 (圖一、右)。

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在實驗過程中多多少少會遇到一些問題,例如有兩個分別貼上DNA及RNA標籤的樣品,在實驗過程中標籤都掉了此時該如何分辨?

也許分辨的方法不只一種,但其中一種是可以利用溶液PH值的酸鹼來辨別,首先將兩管樣品分別取出一些加入鹼性溶液中,再去跑膠則就可以判斷出哪一個為RNA。

RNA在鹼性環境下會有不穩定的現象,甚至會產生降解的情況,其原因是RNA 2號碳上的OH基會受到鹼性溶液(OH-)攻擊,而則造成phosphodiester bond 遭破壞而斷裂行成2’,3’-cyclic monophosphate derivative(如下圖),所以在分子生物中PH值是很重要的介面之一。

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RNA 樣品製備 NGS 定序上機的前端作業方面,Illumina 所採用的方式是使用 Oligo-dT 來篩選出帶有 PolyA tailmRNA,然而這種方式面對品質較差的 RNA 時,將會受到限制,並且一些不帶有 PolyA tailmRNA,將無法被觀察到,因此有其他廠商使用其它的策略發展新的製備方式,如:NuGEN Ovation,它可以使用少至 500 pgRNA 來完成 library,並且即使 RNA 品質較差,依然可以適用。

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圖一、 NuGEN 開發Ribo-SPIA 技術轉成雙股 cDNA

 

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在現今科技進步的社會中,NGS除了扮演尋找SNP與mutation或是de novo sequencing…等等也讓科學家縮短了研究各式各樣基因圖譜的時間。但很遺憾的是目前NGS的前置作業也就是製備library的方法,並沒有可以完完全全代替人力的自動化系統來完成library,因此為了彌補這項缺失Hanyoup Kim,et al.等人開發針對illumina定序平台的自動化library製備系統,此系統稱為microfluidic system,這套系統結合了droplet-based digital microfluidic (DMF),所以library製備可以在此系統完成。(如下圖)

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a. 指microfluidic system,而右上角長條狀的圖示則表是DMF-capillary interface。

b. 左邊圖示原理圖,右邊則是利用microfluidic方法製備DNA library的說明圖。

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    隨著 NGS 技術演進,這項越來越成熟的技術慢慢促進許多領域的發展及快速成長,包括人類發展學、基因表現及調控、基因變異學及年齡與衰老相關研究等,未來更有可能影響醫藥、健康看護、疾病預防及臨床醫藥治療等領域發展。

    樣品製備成 library 提供 NGS 上機在這項技術占有很重要的地位,目前在操作 whole genomic DNA library 時,首先需要面對的問題是如何將 genomic DNA 片段化至適當的大小,並且必須盡可能使斷點隨機及減小 DNA 受損程度。目前常見的方式是使用物理性的超音波震碎,例如:CovarisBiorupter,或是使用液態壓力將分子截斷,例如:Hydroshear,除此之外,尚有使用特殊酵素 (fragmentase) 切斷 DNA 的方式及 transposon 插斷 DNA 的方式。

   微波爐加熱應用在實驗室工作上並不少見,它被使用在促進細胞裂解、加速化學反應,微波爐的放射線被應用在增加酵素裂解蛋白質反應速度,然而應用在處理核酸裂解方面目前則從未被實驗過,若能控制得並再現性高,想必可以同時擁有減少實驗時間及同時處理大量樣品兩項優點。

   微波爐的DNA 的片段化實驗以以下方式來進行,調整不同溫度及時間測試 genomic DNA 的變化,而常見的 Covaris 超音波震碎法以及較少見的高溫處理法被用來當作此項實驗的對照組,處理後以洋菜膠體電泳方式確認 DNA 分子大小分布。隨後,依照 Roche 454 library 製備標準流程建構 library,在 ligation 後的產物,使用 Bio-Rad real-time PCR 試劑分析並且同時放大總量,純化後再以 Agilent 2100 bioanalyzer 自動電泳觀察 library 分子量大小,最後以 Roche 454 pyrosequencing 系統上機定序及後續軟體分析數據。

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人類乳突病毒Human Papilloma virus(HPV)是一種分子較小直徑約55nm的DNA病毒,目前人類乳突病毒有一百多種基因型,不同基因型的人類乳突病毒引起的疾病種類不盡相同,其中以30~40種類型的人類乳突病毒會透過性行為傳染到生殖器或周邊皮膚,而這些種類當中又以10~15種最容易引起子宮頸癌與其他生殖道癌,例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68

被稱為高危險性病毒。人類乳突病毒除了導致大家所熟悉的子宮頸癌之外,在流行病學與分子生物學研究報告中顯示人類乳突病毒也可能造成頭頸癌的發生。

 

加拿大知名生物學家在Human Papilloma virus研究中

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       真核生物的genome size較原核生物大,且有許多條大小不一的染色體,所以在進行optical mapping及定序資料的組裝上較為困難。若能將真核生物的每個染色體獨立的分離出來,再分別進行定序或解出restriction enzyme map,對序列組裝上會有相當大的幫助。

將不同大小型態的染色體分離出來的技術一直以來都有許多研究團隊在開發,其中的技術包含使用micromanipulator配合雷射切割、使用原子力顯微鏡atomic force microscope nanolithography及流式細胞儀Flow cytometry,其中流式細胞儀Flow cytometry是被認為分離效果較佳的技術。

        Flow cytometry是生物學上相當常用的技術之一,例如當一個樣品中混有許多不同特性的細胞在裡面時,Flow cytometry可以依據細胞的顆粒性及螢光染色呈色性,將相同性質的細胞做分群分析且可將同一性質的細胞分別分離出來。不同染色體之間的大小及DNA螢光染劑染色後的螢光相對強度亦不相同,所以可以利用Flow cytometry將染色體獨立的分開來(如下圖)。

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DNA Genotek® OrageneˑDNA ( OG-500 )DNA Collection Kit在臨床上的應用

圖片2  

在實驗室大家應該都有使用過DNA萃取套組 ( DNA isolation ) 的經驗,大部分的DNA萃取套組都需要一定的樣品量或檢體才可以萃取到足夠量的DNA,並且會因樣品取得的難易度及樣品保存的效果而影響後續實驗的結果好壞,倘若萃取出來的DNA品質還要符合生物晶片 ( Microarray ) 或次世代定序 ( Next generation sequencing , NGS )等實驗的樣品要求則難度相對提高許多。

    目前 DNA Genotek® 公司推出一款 OrageneˑDNA (OG-500) 樣品保存套組 (DNA Collection Kit ),可藉由此套組將臨床上病人少量的唾液樣品快速保存起來,經測試此套組所保存的樣品在 24°C37°C 測試條件保存五年,發現所萃取的 DNA 片段長度仍可維持在 23Kb 以上,而在 50°C 保存條件下樣品 DNA 至少可以維持 187( 如表1 )

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科學家們發現在不同環境發現的古生物化石 DNA,其受損降解的情形其實是很類似的,使用次代定序的平臺研究古代 DNA 能夠直接的檢測許多現象,為人熟知的例如:嘌呤丟失作用 (Depurination)、胞嘧啶的去胺基作用(Cytosine deamiation)fragmentation rate……等等。

   圖一是研究人員將始祖馬的次代定序所獲得的讀序,比對回現代馬基因體後所做的統計分析結果,觀察發現古生物 DNA 時常斷裂在嘌呤 (GuanineAdenosine) 的後方 (Y 軸標示 -1 位置),也因此讀序的第一個鹼基 (Y 軸標示 +1 位置) 有較高的機率出現嘧啶 (CytosineThymine ),這一項證據似乎可以證明嘌呤丟失作用 (Depurination) 對於 DNA 斷裂降解的影響。

圖一

新圖片 

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之前我們在”跨越定序平台的迷思”一文中提到,同一個library在Illumina的兩個不同定序機台 (Miseq 及 Hiseq2000) 定序的結果並沒有特別的差異。然而,同一樣品在不同 library 製備方法下,會產生出不同的定序結果嗎?

        2012 年 Joern Toedling 的研究團隊以 small RNA sequencing 做了一系列相關的研究,其將老鼠的 ES_XX (embryonic stem cell line female) 及 ES_XY (embryonic stem cell line male) 做為比較的對象,以不同平台的 small RNA library 的製備法處理樣品,並且分析其定序資料,不同製備法配合樣品的資訊如下表。

新圖片 (2)  作者以 pair-wise Spearman rank correlation 分析上表十個樣品間 miRNA reads 數量的 correlation,並且將結果以 heatmap 形式呈現(如下圖)

新圖片 (3)  

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即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction,簡稱為Real-time PCR),又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應(Quantitative real time polymerase chain reaction,簡稱為Q-PCR)。Q-PCR是藉由PCR擴增原理將DNA放大的同時並達到即時定量之結果,若使用傳統PCR方法來定量的話是較費時費工又容易汙染,因此Q-PCR已經廣泛使用在定量這方面。

 

目前Q-PCR常用化學物質大致上可以分為:非專一性化學物質(SYBR Green )專一性化學物質(TaqMan probe)。分述如下:

1.SYBR Green I

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Library construction過程中,DNA及RNA濃度的精準測定是相當重要的。尤其在製備library之前,必須要了解樣品的濃度,才能取出適當總量的DNA或RNA做為製備的原料,若因為濃度偵測的不準確,會導致最後library產物總量不足夠上機定序。目前常見的DNA及RNA濃度測定方法有吸光值測定法、專一性螢光染劑測定法。

 

一.  吸光值測定法

Beer-Lambert law顯示,分子對於特定波長光之吸光程度會隨著分子濃度而有所不同,所以可以藉由測量溶液的吸光程度optical density推估分子的濃度1DNARNA分子會吸收波長260nm的光,所以可藉由260nm的吸光值換算成濃度(如下圖所示)。此測定法操作簡單且快速,但極容易造成量測的不準確,因為若萃取DNARNA的過程中,溶液混有其他也會吸收260nm波長光的物質,常常會造成高估DNARNA的濃度,進而影響後續實驗的進行。

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PCR-Free 顧名思義是指不經 PCR 步驟而完成 library construction。

一般來說 library construction 都須經由 PCR 放大再做定序,放大後的 library 會產生幾種情況:

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