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SnpEff是用來註解基因變異所造成可能影響的工具,其所需要的檔案及輸出的檔案格式皆為VCF檔,有經過SnpEff註解過的檔案看起來如下:

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前面header line的部分會加上幾行SnpEff的相關資訊,包含有:

(1) 版本資訊

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隨著天氣漸涼,逐漸進入流感盛行的季節,流感為急性病毒性呼吸道疾病,雖免疫力正常的人大多可在醫師的治療下痊癒,但重症者可能造成肺炎而危害到性命,加上有容易傳染散播的特性,所以仍不可輕忽。105年度的公費流感疫苗已於101日可開始於各醫院診所或衛生局洽詢施打,今年度針對免費施打對象有放寬條件,可到衛服部網頁進行查詢1

流感病毒Influenza virus屬正黏液病毒科Orthomyxoviridae,其遺傳物質為單股負股RNA。在主要的分型上,分為A型、B型與C型流感。A型感染的對象為人或其他雞或鳥禽類,也是主要常見的感染種類,A型流感依據表面蛋白Hemagglutinin(HA)Neuraminidase(NA)種類的不同,又可分subtypesH1-H18N1-11B型感染的對象為人與海豹,較少單獨造成大規模的流感疫情,且與A型流感不同,B型流感並無HANA subtypes的分類。C型感染的對象為人與豬,相對於A型或B型流感更少見2。流感病毒難以防範的其中原因是病毒具有容易變異的特性,難以施打一種疫苗便能長期具有保護,變異的情況多為病毒表面的surface glycoprotein mutation或是不同strain間的基因相互重組(reassortment),且其中A型流感能夠在人與雞鳥禽類共通傳染,又更增加其變異與傳染的能力3

目前臨床上若發現病人具有類似流感的病徵,醫師常會使用快篩試劑快速判別是否為流感病毒,以即早給予患者克流感類的抗病毒藥物。快篩試劑組具有及短時間內可以獲得結果的優勢,然而,依據衛福部疾管署的研究4,對於部分病毒量較少的樣品,檢出率僅有50%,因此若需準確偵測病毒且分型,仍須仰賴RT-qPCR的方式,然而,一般的RT-qPCR僅能針對已知的病毒型做判斷,且不易得知病毒基因的變異狀況,若為新種的病毒,則仍然無法進行辨別。

有許多研究團隊以次世代定序技術建構流感病毒檢測平台5,6,7,8,因呼吸道刮棒沾有的病毒所萃取出的RNA不足以直接用來做定序使用,所以主要原理是利用RT-PCR的方式,設計與分型或病理抗藥性相關基因區域的primer,對樣品特定區域進行增幅,但因通常需要耗時的繁複步驟,且新變異的病毒也有可能無法在此技術中被檢測出,因此縮減其在臨床應用的可能性。

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TCGA的舊有使用者應該都有發現,在前一陣子(2016/6)官方進行了一次短暫的維修

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圖表 1 TCGA維修畫面截圖

原以為維修完之後,就可以一如往常的下載所需資料

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“Epigenetics”表觀遺傳學是20世紀80年代逐漸興起的一門學科 表觀遺傳學通常被形容為環境、飲食等因子對DNA外部所做的微小化學修飾,但不改變DNA序列的遺傳變化。包括DNA甲基化、組蛋白修飾(Histone modification)、染色質重塑(remodeling of chromatin)以及經由非編碼RNA(noncoding RNA)的信號通路。

Circulation子刊一項研究結果提示,吸菸者可在DNA上留下持久的印記,並改變超過7000種基因,戒菸後某些基因影響可達30多年。

Pregnancy And Childhood Epigenetics (PACE)協會彙整了在13個規模較小的研究分析。,其中主要透過Illumina 450K BeadChip進行實驗分析,在孕婦和新生兒血液中DNA甲基化,與孕婦吸煙之間的關係超過45CpG islands

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‧什麼是邏輯斯迴歸 (Logistic Regression)

迴歸分析(Regression Analysis)是一種統計學上的分析方法,主要是用來了解兩個或多個變數間的相關程度,並建立模型來預測未知的樣品。當應變數(Dependent Variable)為連續型變數時,通常會使用線性迴歸(Linear Regression)來進行分析;若應變數為類別變數時(特別是兩分類的變數),則會使用邏輯斯迴歸來做分析。

和邏輯斯迴歸密不可分的概念就是「勝算(odds )」,勝算是指某一件事情成功機率和失敗機率的比值。而將勝算取對數(log)後所得到的方程式就是邏輯斯迴歸方程式。

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70年代的研究指出細菌細胞的數量是人類細胞數量的10倍,也就是說細菌的細胞數比上人類的細胞數是10:1,也有科學家推測是100:1,40年來我們都不曾去懷疑過人體身上的細菌數量比人體細胞多,直到2016年初的研究,重新估算了這個比值,認為是1:1 (Fig. 1),一舉推翻了過去幾10年來的估算結果,然而細菌的數量高估,不代表著他的重要性降低,相反的,細菌在人體身上扮演的角色一直被低估的;過去,總是認為這些細菌大多數都是對人體無益的,甚至是有害,受限於培養的研究方式,一直無法全面性的去了解人類身體上的菌群完整圖像,因為絕大部分的細菌是無法被培養的,這種以管窺天的研究方式,直到metagenomics與NGS技術發展,才得以有所突破。

Figure 1 比較1972年的文獻與2016年估算細胞量的方式的差異。

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棲息在你我身上的細菌數量約1013個細胞,這些細菌細胞棲息在皮膚、口腔、消化道等器官,這 1013個細菌細胞涵蓋了超過1,000種的細菌,估計基因體大小是人類的10倍以上,基因數量更是人類本身的50倍以上(估計有100萬個基因),越來越多的文獻研究顯示,這群我們肉眼看不到的鄰居們,影響著我們的生活,多種與代謝相關或自體免疫相關的疾病都與菌相有關,尤其是腸內道的細菌群,涉及肥胖、癌症、氣喘與自閉症等。

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Circular RNAs是一種環型的non-coding RNA,雖然早在1970年就被發現,但在近5年才因為NGS的技術,讓科學家能夠更深入的一探究竟。一般我們熟知的基因,是轉錄後經Splicing形成的線性RNA(linear RNAs),circRNAs則是形成環狀的封閉結構。

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而大家較為熟悉的調控non-coding RNA則是miRNAmiRNA能和目標基因作用後進而抑制目標基的表現。

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孕期缺鐵對胎兒出生後短期或長期的認知及行為異常有關,可能會增加自閉、焦慮、沮喪、睡眠障礙及精神分裂等與神經或精神相關疾病之風險。也許你會覺得既然缺鐵那麼就給予鐵劑治療,然而這樣的治療是有限的,給予鐵劑治療能夠改善急性症狀(感覺、動作障礙),但對於學習力及行為異常的治療則是相當有限。這些永久性的改變,可能與大腦中海馬迴神經元形態與谷胺酸神經傳遞(glutamatergic neurotransmission)異常有關。

科學家們在動物實驗中企圖透過營養素「膽鹼」的補充(補充時機:妊娠晚期或新生兒哺乳早期)來彌補孕期缺鐵對子代造成的健康危機,目前發現改善行為異常、認知障礙以及扭轉了基因Bdnfbrain-derived neurotrophic factor)基因外修飾,但對更深入的分子機制仍不清楚。(選擇補充膽鹼的原因可能與膽鹼參與體內的單碳代謝及作為甲基提供者有關)

20162月發表在JN的研究報告,作者將懷孕的SD大鼠分成四組包含控制組(IS)、控制組補充膽鹼(IS-C)、缺鐵組(ID)及缺鐵組補充膽鹼(ID-C),在子代出生後第65天犧牲,取其大腦海馬迴組織萃取RNA,利用NGSRNA-seq)及IPA(Ingenuity Pathway Analysis)去分析海馬迴轉錄組(hippocampal transcriptome )基因表現差異及影響的基因網絡。結果顯示:缺鐵組之成年子代相較於控制組,海馬迴的轉錄組被重新編程(reprogrammed)NGS定序ISID海馬迴轉錄組 10,787 loci 分析後發現有377 upregulated gene242 downregulated genes,而被改變的基因網絡主要與神經系統發育及心理障礙有關(圖一)。缺鐵組補充膽鹼相較於缺鐵組確實改善了缺鐵導致的基因表現,影響的範圍包括神經系統疾病(自閉症,精神分裂症,阿茲罕默症),神經傳訊和細胞微管動力。在先前的文獻中已經證明孕期缺鐵會改變子代RNA polymerase II的活性及修飾Bdnf啟動子的histone H3而造成海馬迴基因Bdnf長期的downregulation。懷孕末期藉由膽鹼的補充還原了缺鐵所引發之基因的再程式化,可能與膽鹼促使DNA甲基化相關(仍需證明)。在未來應用上,也許可以透過膽鹼的補充輔助治療高風險者(:缺鐵性貧血的懷孕婦女),使下一代免於神經引起的相關疾病。

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在大家的研究的過程中,應該很容易遇到需要將組裝的基因體上傳到NCBI資料庫上的需求。現在這些步驟,可以很輕易地使用一連串NCBI提供的網頁介面或是工具完成,這篇文章就來簡單的介紹這些工具該如何使用。

利用 NCBI Submission Portal 上傳 draft genome

2014NCBI更新Whole Genome Shotgun (WGS)資料的上傳方式之後,現在上傳draft genome (意即組裝序列中間有N,或是未完全連接起來的scaffolds)的步驟變得非常簡易以及方便。可以直接根據網站上的指示,一步步地完成上傳工作。

首先登入你的NCBI帳號,並開啟Submission Protal頁面(https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/),如下圖,便可以看到Genome (WGS) 的上傳頁面

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在表觀基因體學中,Histones與其上攜帶的修飾是否可以被帶到下一代中一直是核心的爭論議題。不像是DNA或是其他核酸樣板的修飾,Histones修飾的遺傳性一直都還未能解決。主要原因在於Histones到底是如何的在核酸複製時產生之replication fork中同步遺傳仍然是未解之謎。

不過有越來越多的證據顯示在Histones上的標記應該是可以進行遺傳的。在2015年的兩篇Science發表的報告顯示了H3K9甲基化是可以遺傳到好幾個細胞世代。MoazedAllshire的團隊分別發現了這個現象,如下圖一,在Clr4 H3K9 methyltransferase作用下,H3K9me可以在不同世代的酵母菌(Schizosaccharomyces pombe )中產生遺傳作用,而且是在沒有cis-acting transcription factors或是相關DNA sequence情形下產生。重要的是,需要抑制住Epe1(一個推定的 demethylase)之作用。在Strome等人也發現類似的現象。他們在C. elegans上發現與Polycomb repressive complex 2(PRC2)有關的H3K27甲基化在沒有PRC2的時候也能夠表現在子代。雖然有這些證據,但是詳細的分子機轉仍然有待研究。有部分可能可由PRC2之結構有關。

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圖一  H3K9me defines a silent state that can be epigenetically inherited.

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有研究指出有40%的機率成年男性/女性會發生禿頭(這裡指的是一般常見的雄性禿androgenic alopecia),而發生的主要原因為毛囊對於具有高活性的雄性賀爾蒙(雙氫睪固酮)感受性增加有關,意即是體內的雙氫睪固酮被生成可能會導致毛囊萎縮造成落髮。血液之中會含有許多的雄性賀爾蒙(睪固酮)絕大多數(~97%)會和血漿蛋白結合而不會進入毛囊組織中,但仍有少數(~3%)游離的睪固酮會進入組織中並與 還原酶 (5 alpha reductase)作用生成雙氫睪固酮(DHT)(如圖1)。接下來,毛囊組織中的雄性激素受體androgen receptor會分別和這些睪固酮及雙氫睪固酮結合並進行後續的調控,而影響毛囊的生長(如圖2)

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1.()酮與5α還原酶作用産生雙氫睪()酮。

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在定量上,digital PCR (dPCR)real-time PCR (qPCR) 間最大的不同,是digital PCR利用chipdroplet的形式將需要定量的樣品分隔成大量的小分隔,將稀釋的樣品侷限在各分隔中來進行反應,對個別分隔偵測樣品存在與否來決定樣品分子的數量。目前dPCR已被廣泛用於基因序列變異的偵測,如copy number variants或點突變。在分子診斷上,dPCR被應用於癌症學、傳染病學、胎兒基因篩檢及移植排斥反應的預測等。

Rare sequence mutationcopy number數量的偵測為dPCR的優勢;由於dPCR是藉由單一分隔的陰性或陽性訊號來判別,因此不會受限於PCR增幅效應的影響,不需標準曲線來推測分子數目,屬於絕對定量,對於微量樣品的偵測相當有利;但微量定量實驗中,若出現primer設計不良或樣品污染的情形造成false-positive,則會對實驗結果造成極大的誤差。

Rare Variants

若利用dPCR來偵測rare variants,可能發生困難的原因有下面幾個情況:一為dPCR對結果的高度敏銳性並無法避免實驗可能出現的cross-reactivity (fig. 1);用以偵測mutant的引子有可能以較低的增幅偵測到wild type的訊號,若要讓wild typemutant間的差異顯著到能夠被區分,需要調整PCR的條件或重新設計更為適用的引子對。另一個狀況,雖然dPCR有能力從10000wild type序列中找到一個SNP,但也意味著需要50000gene copy數來保證樣品中含有至少一個目標SNP的可能性達到99%,而這樣的樣品濃度在定量上很可能過高,而且在部分案例也很難收集到如此數量的樣本。

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16S metagenomics中,操作分類單元Operational taxonomic unit (OTU)是根據序列的相似性做分類。其方法為叢集相似的16S rDNA基因序列的定序的片段。在每一個叢集中根據設定的序列相似性程度呈現一個OTU,形成的OTU可能為細菌的屬或種層級。一般而言,在16S metagenomics分析中97%99%的序列相似性為典型的OTU叢集分析的門檻。

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在進行16S序列相似性分類後,將得到的每一個OTU視為與資料庫對應相符的細菌種層級上的分類物種,並繼續進行16S metagenomics分析流程。然而實際上其解析度是有所限制,並非單一OTU為完全對應對單一菌種。影響解析度的因素如下,以16S rDNA基因相似程度97%為例:

一.  某些物種間的基因序列相似程度大於97%,因此分類出的OTU中將包含多個物種。

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過去的研究顯示,基因表現調控的方式與 DNA甲基化以及 histone modification 有重要的關係,但它們彼此之間是如何透過交互作用而調控基因表現卻不是十分充分的被研究。DNA的甲基化現象是經由 DNA methyltransferase 將甲基經催化反應標誌在 DNA 上,通常能抑制轉錄作用;而histonemodification 後能改變 chromatin 結構進而影響基因表現,其中由 Polycomb-repressive complex 2 (PRC2) 中的 histone methyltransferase EZH2 催化 H3K27 甲基化形成的 H3K27me3,科學家們發現總是可在一部份被抑制的基因 promoter 上觀察到,因此,H3K27me3可能也與抑制基因表現脫離不了關係,在過去研究中也一直認為  PRC2  H3K27me3與抑制基因表現具關聯性 (圖一)

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圖一、各種催化 H3K27 甲基化的組蛋白最終造成終止轉錄反應

在癌症方面的研究,時常被提到與不正常的基因調控相關,若抑制 cancer cell 形成的基因,其 CpG island (CGI) promoter 被不正常的甲基化後抑制基因表現,可能為造成多種癌症的生成的原因之一。基於以上理由,科學家嘗試使用次世代定序中的 ChIP-bisulfite sequencing (ChIP-BS-seq),分析 normal 以及cancer cell的差異,針對 H3K27me3 附著 DNA 位置,企圖了解 H3K27me3 與其附著 DNA 甲基化之間的關係。步驟為:免疫沉澱回收後,進行一般 ChIP –seqlibrary 的製備過程直到 ChIP DNA 兩端接上 adapter,然後再使用 sodium bisulfite 進行 C-T 轉化,轉化後的單股 DNA 進行 PCR 放大完成 library (圖二),由於 adapter 是完全被甲基化的設計,因此不用擔心被轉化的問題。定序後,我們可以將資料與不進行bisulfite 處理的 ChIP-seq 資料進行比較,也可以進一步在 cancer cellnormal cell彼此間,進行差異性的比較。

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過往我們進行RNA-Seq時,會使用RPKM或是FPKM來代表某個gene或是isoform的表現量多寡。可是當我們想要比較不同次實驗內的某個基因,其表現量相較於「整體基因表現」而言,是否維持在「固定比例」時,便無法使用這樣的計算方式。因此Wagner et. al. 在2012年的時候提出TPM (Transcript Per Million) 的概念來補足這個缺點。我們將利用以下的表格來進行FPKM以及TPM之間的解釋以及比較。

假設某個生物具有4個基因,分別為A, B, C, D。然後我們做了3次的RNA-Seq實驗,將獲得的reads與每個基因進行比對,其比對的數目如下表所示。

 

Replicate 1

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近幾年定序技術的發展迅速,越來越多人使用次世代定序(NGS)進行基因檢測,試圖找尋個體中基因的變異,藉此來了解未來患病的風險或是患病的原因;如何詮釋基因上的變異,是當今最重要的課題之一;由下圖 (Fig. 1)預估的數值,在NGS的費用上,成長最多的有三項,分別是 Biological interpretation、Data Management與Experimental design;反之,定序所佔的比重下降許多,從百分之30下降到百分之5。簡而言之NGS是未來的趨勢,而Biological interpretation (詮釋)、Data Management與Experimental design又是趨勢中的趨勢,很難忽視其重要性。

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Fig 1. NGS 費用所佔比重變化。 Source: Yale University; Frost & Sullivan

然而,在biological interpretation尚未有一個統一且適用性高的標準,因應這樣的情況,2013年美國醫學遺傳學暨基因體學學會(ACMG, American College of Medical Genetics and Genomics)與分子病理學學會(AMP, Association for Molecular Pathology AMP)探討如何解讀新一代的定序技術之基因檢測結果,並將其結論與建議,整理成" Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants",並發表在2015年5月的《Genetics in Medicine》上,這個標準可運用在各類孟德爾遺傳的基因檢測項目上 (註1),並將其變異進行分類與結果詮釋。全文大約可以分為兩個部分,一個部分是所需要注意的事項,例如,文獻引用、data base 與predict software使用,第二個部分是判斷準則與計分方式,將變異點位的證據加成並權衡後,再將變異點位的類型分為Pathogenic(致病)、Likely pathogenic (可能致病)、Uncertain significance (不明確) 、Likely benign (可能良性)與Benign (良性)總共5種類型。這兩個部分相輔相成,判斷準則與記分方式必需要基於的一個部分的原則,才能夠有準確的判斷結果。

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美國癌症基因體圖譜計畫TCGA ( The Cancer Genome Atlas ) 是由 美國國家癌症研究所National Cancer Institute (NCI) 與 國家人類基因體研究所National Human Genome Research Institute (NHGRI) 從2005年開始共同合作的一個大型研究計畫。此計畫大規模地蒐集特定癌症病患的相關臨床記錄、腫瘤組織以及相對應正常組織,進行定序以及生物資訊分析,整合資料並公開定序資料與分析結果於官方網站供大家瀏覽及下載,利於世界各地的科學家、研究人員或是學術單位取得使用。其目的是希望流通知識、促進研究,並打造完整的癌症基因組資訊,助於癌症的預防、診斷與治療。

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TCGA至今已經蒐集逾11,000個癌症病患以上的資料、33種不同的腫瘤型態、其中更包含10種較罕見的癌症、並以7種不同的資料型態紀錄,總資料量更超過2.5 petabytes。TCGA包含著豐富多元的資料,使用TCGA資料做研究、寫論文的人也越來越多。下面我們將以簡易圖文示範如何下載資料。

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由於國人飲食習慣的改變,加上近年來發生的食安問題,台灣罹患大腸癌人數不斷上升,依照國健署統計,民國91年與現在相比,每年罹患大腸癌的人數已上升兩倍之多,躍升為台灣國人最常罹患的癌症。但雖然發生頻率很高,以目前的醫學上的治療技術與策略,只要在早期發現,存活率高達90%以上,所以定期的篩檢,盡可能早期發現是相當重要的。目前台灣國健署有補助50歲以上至未滿75歲民眾每2年1次糞便潛血檢查,就是希望能讓民眾早期發現,以降低大腸癌患者的死亡率。

       目前傳統臨床上被廣泛用來篩檢或診斷大腸癌的方式主要分為兩類型1,非侵入性篩檢與侵入性檢查。

  1. 非侵入性篩檢:國健署補助的非侵入性篩檢,主要是使用免疫法糞便潛血檢查(Fecal Occult Blood Test and Fecal Immunochemical Test),當發現糞便有潛血反應時,再進一步做侵入性的檢查。
  1. 優點: 採檢過程簡單,檢驗費用便宜,檢驗結果不因受檢者飲食或食用藥物而有所干擾。
  2. 缺點: 準確度不高,糞便潛血陽性受檢者,大約只有10%最終確診為大腸癌,所以偽陽性相當高,除此之外,並非所有大腸部位的瘤在早期會有出血的狀況,所以也常常發生偽陰性的狀況。
  1. 侵入性篩檢: 結腸或大腸鏡篩檢,受檢者於檢測前一至兩天先進行低渣飲食,並於檢測前服用強力瀉藥並配合禁止飲水,醫師以內視鏡的方式,由肛門進入腸道檢查,並目視判斷是否有病變。
  1. 優點: 極高正確率的診斷方法。
  2. 缺點: 受檢者須特別控制飲食並服用瀉藥,會造成身體不適。另外,若檢查過程中,不施打麻醉藥,腹部也會有相當程度的不適,但施打麻醉藥,則有可能檢查過程內視鏡傷害或刺穿腸壁而無法早期發現。除此之外,雖然此方法正確率極高,但若過於早期且瘤太小,也可能造成醫師無法目視到相關的病變。

    台灣大腸癌常見篩檢方式

    類別

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什麼是支持向量機(Support Vector Machine)

支持向量機(Support Vector Machine,簡稱SVM),是一種機械學習(machine learning)中監督式學習(Supervised learning)的方法,可以廣泛的應用於統計分類(classification)和回歸分析(regression analysis)

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SVM最主要的概念,就是希望可以在一個由不同類別混合而成的資料集中,依據一些特徵(feature),找到一個最佳的超平面(hyper plane)將不同類別的資料分開來。所謂最佳的超平面就是其距離兩個類別的邊界可以達到最大,而最靠近邊界的這些樣本點提供SVM最多的分類資訊,就叫做支持向量(Support Vector)

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我是慈濟大學醫學資訊學系學生張郁琳,於系上提供的資訊系統開發實習課程,來到了 有勁生物科技有限公司,具有兩大部門:實驗部門、生資部門,而我的實習單位為生資部門。

生資部門負責任務如下圖橘色區塊的基因檢測流程圖,主要將實驗部門定序後的資料,以電腦處理進一步的生物資訊的基因分析,最後再將其分析結果製作成報告並呈現給客戶。

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                                           (基因檢測流程圖,為有勁生物科技有限公司官網流程圖)

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