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圖一: circRNA的生成及功能(圖來源: Wilusz, J. E., and Sharp, P. A. (2013). Molecular biology. A circuitous route to noncoding RNA. Science 340, 440–441. doi: 10.1126/science.1238522 )

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Long Non-Coding RNAs為一種不會轉譯成protein的transcripts,長度通常大於200bp,最長可超過10000bp,部分的lncRNA跟mRNA一樣會有alternative splicing,因為和基因的結構相似但不會轉譯成蛋白,早期稱為假基因(pseudogene) ,然而越來越多的研究顯示lncRNA本身參與許多生物調控,如下圖

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Biocomicals (網址:http://www.biocomicals.com/comics/,生物相關漫畫部落格)

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相信許多人都看過侏儸紀公園這部電影,藉由DNA的解序有機會可以重現已滅絕的生物,然而,現階段的生物技術實現侏儸紀公園的場景,還有一大段路要走,主要原因便是DNA品質問題,化石內的DNA遭受了千百年,甚至上百萬年的氧化、水解等化學反應,DNA的化學結構已經有明顯的改變,不但,破碎且含量非常微少,這篇文章主要是要來探討古老DNA定序所面對的問題。下述三個類型的化學反應是在化石中常見的。

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在哺乳動物,DNA 甲基化通常發生在CpG dinucleotides 上,而且是研究基因調控和疾病誘發重要的epigenetic mark 。詳細的了解 DNA 甲基化程度和位置對於研究發育 (development) 和疾病型態 (disease phenotype) 有很大的幫助,尤其以癌症來說,甲基化的研究可以提供診斷的 biomarker。在哺乳動物的DNA大約有~1 % 的 5’-methylcytosine (5MeC), 其中這甲基化有70~80% 位於CpG dinucleotides。但是DNA methylation pattern 在每一個個體或是組織會有所不同,是處於一種動態的模式,這樣的情況讓基因的定序常常有偏差的情況發生。

  近年發展了三種研究 DNA 甲基化的主要方法:

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定序的技術不僅讓英國科學家 Frederick Sanger 於諾貝爾化學獎梅開二度外,亦深深奠定往後次代定序 (Next- generation sequencing, NGS) 的基礎,此項技術將生物、化學與電腦運算三者整合為一,徹底改變多樣化的基因組應用,更帶來劃時代進展,其目的無非是將生物體內大量的有字天書作趨近於完美的詮釋。為了因應大量序列數據的辨認,因此發展出條碼系統(Barcode system),拜此辨識概念的引入,即允許混合多數樣品並於同時間進行大量定序(Bystrykh, 2012),本文主要探討條碼對於次代定序的貢獻,從日常生活的有形化乃至生技層面的無形化,比比皆是,隨處可尋條碼的蹤跡,可見其對於人類生活息息相關,以下分三部分做詳細介紹:

壹、日常生活應用

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非洲裸鼠 (Naked mole rat) 學名:Heterocephalus glaber 是一群在東非地底底棲生活,大小約 8-10 cm,重約 30-35 g 的鼠輩,牠們擁有一般地底生物常見特性,例如:耐熱、耐 CO2、視力不佳、能敏銳感受震動,牠們進行鼠類中少見的團體生活,並且具有哺乳類動物中唯二的真社會化系統 (Eusociality),只有女王鼠能與少部份雄鼠繁衍後代。

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    次代定序( Next- generation sequencing, NGS ) 的技術自發展以來,應用層面相當之廣泛,舉凡:學術研究、醫學檢測、藥品查驗以及考古起源等,日新月異的定序技術發展之下,使得原本躓礙不前的考古科研有另一層突破性進展,本篇主旨探討利用NGS 巧妙的運籌帷幄,一窺歷史的跡象,揭開對古代生物迷思。古人曾云:「以史為鏡,可以知興替」。古老生物的遺傳密碼在NGS 抽絲剝繭下,間接了解生物演進,這些遠古的遺傳物質aDNA ( ancient DNA ) 經長年累月的歲月摧殘,會產生一些自發性的變異及損壞 ( 如:氧化、水解與 DNA crosslink ),或因外發性的降解 ( 如環境中的微生物所分泌核酸水解酵素,直接崩解 DNA 結構)。形成aDNA 三個主要特性:短片段、嘌呤丟失作用( depurination ) 與去胺基作用( deamination ) (Sawyer et al., 2012),亦在先前之『利用NGS觀察DNA降解現象』一文中,詳細敘述相關的發生過程及原理,但這些現象往往左右定序的正確性,容易造成鹼基配對錯誤 ( misincorporation 或稱 miscoding lesions ) 現象,導致產生錯誤的序列訊息,以下就由三方面的研究作介紹。

壹、遠古動物的研究方面:

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真核生物rRNA包含28S、18S、5.8S、5S四種rRNA,一般在判斷RNA是否有降解時,會去觀察28S與18S rRNA的狀況,在RNA品質佳的狀態下,28S rRNA總量應為18S rRNA的兩倍左右,如下圖分別為哺乳動物的RNA proflie,

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NGS 的高輸出量特性,帶給基因體學研究上的突破,然而,目前技術仍有存在一些缺陷,其中最令人詬病的點是定序深度不均勻,造成 NGS 必須提升定序深度,來彌補定序深度不均勻的問題。造成定序深度不均勻的原因很多,其中最明顯的就是序列 AT 或 GC bias 造成,往往 high AT 或 high GC 的區域很難得到滿意的定序品質與定序深度;有一部分的原因很可能是 library 製備過程中造成的,一般 NGS DNA library 製備流程包含,fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation、PCR 等步驟,製備流程中,所有的環節都有可能會造成bias,當然包含每一個純化的步驟。為了釐清到底是哪一步驟造成,Aird 團隊利用 QPCR 來檢驗 library 製備流程產生 bias 的情況 (Aird et al. , 2011),結果整理於圖一,縱軸是序列的數量,橫軸是 GC content 的百分比。由圖一可以清楚地觀察到,library 製備的流程中,PCR 過程是造成 bias 的主要原因 (圖一);而 fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation 等步驟,不太會產生 high AT 或 high GC 的區域定序深度下降的問題。

圖一

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不管是測DNA、RNA或是protein濃度單位大多以ng/μl為準,很少會以nM為單位。因此對於這方面的單位換算來說許多人都很陌生,也因為陌生可能導致遺忘如何換算或因陌生而不敢接觸,所以在這我們將舉個簡單的例子來說明ng/μl與nM的單位換算方式。
例子1.

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病毒在生物界扮演著舉足輕重的地位,幾乎所有的生物都能被特定的病毒所感染。而昆蟲同樣對於生物界以及人類非常重要,保護對人類有益的昆蟲,以及研究傳播病害的昆蟲是非常重要的事,例如:保障蜜蜂以及幼蠶的健康、探究疾病媒介昆蟲的帶毒,或是利用病毒製作生物性殺蟲劑等等,都是科學家們努力研究昆蟲病毒的目的。

   在過去,科學家們已花了許多時間研究昆蟲體內所帶的病毒種類,然而,並非所有的病毒都能夠被傳統的實驗技術所偵測到,過去常用在研究昆蟲病毒的技術包括了:直接觀察的TEM、血清學的ELISA、以核酸雜合為主的Southern、Northern blot,也有人直接分析 EST Library 的序列,找出新的病毒,不過這會受限在病毒濃度高的狀況下,後期常見有人使用 Microarray 技術監測如蜜蜂族群的帶毒率,但這項技術受限在只能偵測已知的病毒種類。

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融合基因 (fusion gene) 經常發現在血癌、前列腺癌及軟組織肉瘤中,並且有越來越多證據顯示與導致該癌症的發生有關係。融合基因的形成是由於染色體發生了易位 (translocation) 、刪除 (interstitial deletion) 或倒置 (inversion) 所造成,融合基因所表現的融合蛋白 (fusion protein) 在功能上會有所變異,以慢性骨隨白血病 (Chronic myelogenous leukemia) 中 BCR-ABL  融合基因為例,BCR-ABL 會表現成 tyrosine kinase 並活化細胞周期調節系統中的控制週期蛋白,加速細胞分裂,並抑制 DNA 修復,導致病變,並且在 95% 的患有慢性骨隨白血病的病人中皆有 BCR-ABL 基因,因此可當成 biomarker 來判別是否罹患慢性骨隨白血病。

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RNAi 的原理漸漸被了解發現的同時,許多研究病毒的學者很快就嘗試運用這個天然的機制,來控制病毒在寄主體內的複製與發病。由於許多造成嚴重病害的病毒以 RNA 病毒為主,因此在植物病理學上,亦或是醫學上,都曾嘗試過使用 RNAi 的機制,抑制病毒的複製或是表現蛋白。在 Fire Mello 研究中提到過 RNAi 的反應會經由少量的雙股 RNA 觸發,並放大擴散整個效應,而在後續的研究中,逐漸了解這是因為雙股 RNA 被酵素RNase H剪切成為小分子的 RNA 片段,被稱為“small RNA”。這種小分子的 RNA 的反股會跟細胞內的複合物 RISCRNA-induced silencing complex)做結合,進而專一性的降解所有與這些小分子 RNA 互補的 mRNA 序列,使寄主達到如同免疫的效果。

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1990 年,一群植物生理科學家— Richard Jorgensen 的實驗團隊,嘗試在矮牽牛 (Petunia) 上增豔花朵顏色,而它們使用的策略是現今發展相當成熟的農桿菌轉殖基因技術以及組織培養技術。chalcone synthase (CHS),是一種開花植物形成花青素的化學路徑上,決定合成效率的關鍵酵素,當時,Jorgensen 使用高效能之 35S promoter 來大量表現矮牽牛之 CHS 酵素,他期望能產出色澤更為飽滿的美麗矮牽牛,但結果卻令他萬萬想不到。

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