目前分類:次世代定序NGS (34)

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作者:林佑軒/有勁生物科技

 

日常生活中,我們去金飾店購買以重量計價的金飾時,要如何確認同一金飾在不同店家其秤重結果會一樣?店家的電子秤通常都已經過砝碼校正確認,而這些砝碼本身也都校正過並確認對應符合國際度量衡局的標準重量,所以使用經砝碼校正後的電子秤,不論何處買的金飾,店家皆應能提供公正的重量及售價。在NGS應用領域中,是否也有類似砝碼那樣的校準物可參考呢?

 

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作者:陳崇斌/有勁生物科技

 

汰換速率快、生命週期短一直是科技產品的特性。新科技產品的推出,有可能創造出更新或更多的需求─例如:1990年代的傳統電腦產業vs今日的互聯網與社群媒體;但也可能會造成需求萎縮,最有名的例子是子午線輪胎─1946年米其林公司發明耐用度4萬英哩的子午線輪胎,取代了之前每1.2萬英哩就需要汰換的輪胎,子午線輪胎於1970年代開始被廣泛使用,卻造成輪胎需求數量的下降,畢竟人們日常的開車里程數,並不會因為輪胎耐用度提升而增加1。 (讀到這裡時,大家應該就明白為何今日的科技產品耐用程度普遍不佳了)。需求量能不斷擴增的高度成長市場有其特性,那就是:能在滿足「現有需求」的同時誘導出「更新的需求」;例如:今日的互聯網與社群媒體,其特性就是越多人使用價值越高。如果一個更好更進階的商品,卻僅滿足了「現有需求」,而未能刺激出「更新的需求」,則由於使用人口並沒有成長,市場需求量就會逐漸減少,例如:子午線輪胎。

 

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作者:金漢強/有勁生物科技

 

從第一台商業應用的次世代定序儀器推出至今已有十餘年;此期間的次世代定序技術與應用持續蓬勃發展。而次世代定序應用服務,尤其是臨床上的,應該如何進行呢?最近一期《基因體與人類遺傳學年度回顧期刊Annual Review of Genomics and Human Genetics》1提供我們如下的建議。

 

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作者:李覺白/有勁生物科技

 

疾病表現型 (disease phenotype)所對應的基因型 (genotype),對科學家了解疾病致病機制及生物體代謝路徑來說是很重要的資訊。隨著基因體技術的進步,不同解析度下被找到的變異基因型與疾病表現型的關聯快速大量被發現,並登記在生醫資料庫中供使用者查詢。本篇簡介近二十多年來應用在基因型辨識的技術及目前常使用到的基因型對應疾病表現型資料庫。

 

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作者:黃勤方/有勁生物科技

 

「我的名字叫江戶川柯南,原本是個名偵探,不幸被歹徒灌下毒藥而變小。身體雖然縮小了,頭腦還是一樣的好。無論如何,真相只有一個!」如果你和筆者一樣是個七年級生或者剛好跟筆者一樣熱愛推理、蒐查破案等劇情片的迷妹迷弟們,相信這段經典對白一定不陌生。如果你對以上不感興趣也沒關係,面對性侵、離奇兇殺案與無名屍等等社會新聞,一定會問「兇手到底是誰?」「這個人是誰?」。事件會隨人們日常柴米油鹽而逐漸淡忘,但法醫和科學家們仍鑽研一個合適的科學方法去揭露真相。

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作者:沈淑華/有勁生物科技

 

癌症發生的真正原因一直未有明確答案,因此癌症研究向來是生醫學界的熱門話題。近幾年科學界大量投入「基因體」研究,進而發現「基因突變或缺陷」有可能是癌症發生的關鍵。基因是主宰體內細胞生長的基礎,一旦基因發生問題,導致細胞異常增生累積,就有可能形成腫瘤。

 

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作者:張美虹/ 有勁生物科技

 

群集分析( cluster analysis )主要目的是將一大筆資料精簡成少數幾個同質性次群體( homogeneous subgroups ),以便從雜亂無章的一大堆原始資料中,做到分類、分群的目標。

 

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作者:林志鵬/有勁生物科技

 

有勁生物科技股份有限公司 (Yourgene Bioscience),成立於2010年,是台灣一間同時擁有國際認證的基因體核心實驗室與專業生物資訊部門的生技公司。本公司擁有Illumina 及 Ion Torrent 兩大定序平台與相關定序設施,且基因體核心實驗室的定序技術更是獲得Illumina Certified Service Provider與Ion AmpliSeq™ Exome Certified Service之認證,更在2016年底以股權交換和現金,合計720萬英鎊(約合新台幣2.7億元)被英國上市公司Premaitha Health收購。此外,實驗室也獲得了ISO 17025 認證並參加CAP舉辦的能力試驗,擁有最可靠與最標準化之操作定序技術。

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NGS技術中,降低錯誤率一直是很重要的一個環節。尤其是在癌症領域、法醫鑑定、遠古生物的基因體學、cell free DNA應用、metagenomics應用等領域,目標就是要正確地偵測到頻率很低的變異點位。也因此在實驗方法上如果會造成非特異性的錯誤率太高,就會無法正確的將非常稀有的變異點位找出來,這樣的點位會淹沒在非特異錯誤之中。

在2012年,Quail, M. et al. 曾經測試了當時各種定序平台的錯誤率,在當時,illumina 定序平台之隨機錯誤率基準值在0.1~0.5% 之間,而其他定序平台則在>1%。然而經過3年的時間,各家定序平台都推出了新版本的反應試劑,像是Ion Torrent 系統推出了Hi-Q定序試劑,Illumina 系統推出了SBS kit V2。這些定序試劑藉由更改化學配方與反應酵素,嘗試著降低各種可能的錯誤。在2015年,尚未有看到詳盡的新版本評比資訊,但隨著不同廠商不同機種的持續推出,可以期待未來在定序機台本身會有更好的表現。

 

High fidelity PCR enzyme

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Ion S5 五大特點

科技始終來自於人性,基因探索解開生命謎題,隨著科技的發展,很多人性化的設計於是乎一一的成形,造就許多劃時代的發明,最顯著的例子就是智慧型科技產品,把電腦結合手機,改變世界流行。次世代定序(Next Generation SequencingNGS)隨著生技與資訊潮流的演進,更是將儀器整併,發展成實驗室的桌上型,Ion Torrent 研發『Ion S5』新一代的定序儀,以簡單操作為前提,讓生技耳目一新,本公司也接軌NGS最新訊息,2015年第4季也率先引進,兼顧定序品質與效率,目的為向上提升與更新,讓您獨步NGS的生技流行。

Ion S5』提供五大定序特點,如下所敘:

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在2013年底,Nature Method 期刊將單細胞定序選為年度技術。在發育生物學、腫瘤基因體學、生殖醫學等領域,單細胞定序技術已經開始發揮它的威力,為我們帶來許多珍貴的訊息。本篇主要著重於此技術在當前的現況,介紹目前的單細胞分離技術、放大技術、與一些應用的面向。第一部分將先介紹技術的部份,第二部分將整理一些已發表的應用情形。

單細胞定序的流程,大概可分為1. 單細胞分離,2.依照不同的需求放大樣本進行定序。可以參考圖一。

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 圖一 單細胞定序的流程(圖片來源: Single-cell sequencing Vol.11 No.1 | JAN 2014 |Nature Methods)

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    定序技術不斷推陳出新,自諾貝爾化學獎得主Frederick Sanger起,迄今核酸定序之成本、時間與技術,也逐年的縮短與降低。本篇主要介紹半導體對於定序的應用,其中喬納森羅斯伯格(Jonathan M. Rothberg)扮演著舉足輕重的角色,他是位專精於生物領域的發明兼企業家(圖一),同時也是454生命科學公司(454 Life Sciences)的創業者,成功研發焦磷酸測序技術(pyrosequencing),就在羅氏公司(Roche)併購了454生命科學公司的同年,他創立Ion Torrent公司,羅斯伯格本身亦是蘋果公司創辦人賈柏斯 (Steve Jobs) 的推崇者,因而IT Information technology角度捕捉靈感,進一步將半導體微晶片的概念,跨領域的導入定序技術中,不僅在基因定序領域中具有開創新穎性,其所創造的生技經濟效益,更被富比士財富雜誌評選為封面人物(圖二)

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(圖一)

 

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為確保育種者的智慧財產權避免侵權事件、檢測作物是否為混合品種與協助追查農產品走私等皆需進行作物品種鑑定,因此良好的鑑定技術將有助於作物品種鑑定。

 

近年來國內已有多個單位透過簡單重複序列分子標誌多型性分析進行作物品種鑑定,以下針對簡單重複序列進行相關說明:

簡單重複序列 (simple sequence repeat) 簡稱SSR,又可稱為微衛星序列 (microsatellite),是一種以2~6個核苷酸為一個 motif 的重複性序列,普遍存在於所有原核與真核生物基因體 (genome) 中。簡單重複序列於單一基因座 (single locus) 具有多重對偶基因 (multiple alleles) 與共顯性 (codominance) 遺傳的特性,此外簡單重複序列motif發生突變的機率相較於基因體的其他區域高,促使簡單重複序列於每個個體間存在著高度的變異性進而造就簡單重複序列成為鑑別度良好的分子標誌。

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自2005年Roche推出Roche/454 Genome Sequencer 20 System後,開啟了次世代定序的大門,經過不到10年的時間,第三世代的定序技術平台也問世了。本篇文章主要是介紹2010由Pacific Biosciences 公司發表的定序平台---PacBio RS,以及其定序原理---Single Molecule Real Time (SMRT) technology。

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Figure 1. Zero-mode wave-guides (ZMWs) – small well-like containers & SMRT Cell & PacBio RS (擷取自http://smrt.me d.cornell.edu/FAQs.html)

 

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近年來,生物技術發展多樣性,以及許多高分子材料(如:奈米粒子)的研究精進,其中更以『磁分離(Magnetic separation)』概念的純化機制,結合分生、物理與化學三者合一,具實驗獨特性。此技術涵蓋範圍廣泛,在核酸領域的應用方面,舉凡:poly-A mRNA的分離、DNA的純化與次代NGS定序,都有此技術參與其中,除此之外,也可應用於蛋白質純化,免疫學等用途。分生實驗過程的核酸分離和純化,會因目的性不同,而於帶磁性奈米粒子的表面,鑲嵌不一樣的配體(ligand),以利進行結合與親和的反應,常見例如:結合poly-A mRNAoligo-(dT)streptavidin等鑲嵌配體。這類型的實驗分離方式,泛稱為SPRISolid Phase Reversible Immobilisation)是一種固相-液相可逆化固定的分離純化技術,比起矽粒子(主要成分為SiO2)的分離更有效率,此項發明影響生命科學實驗的發展,有著舉足輕重的地位,亦逐漸成為現今NGS製備Library方面,於DNA的純化分離與分子量大小之篩選(size selection),不可或缺的一項工具,也是實驗步驟不可缺少的環節。

磁珠的發明構想與概念,最初由任教於挪威科技大學的化學家John Ugelstad 所研發製成,他在聚合物和膠體化學的領域貢獻甚多,也於1976年以聚苯乙烯(Polystyrene)為主要材質,製造出均勻磁化的球體粒子稱為Dynabeads® ,這也是影響日後生物實驗材料革命性的重大突破。

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A型流感病毒是人類最常感染的流行病毒 。以2009年發生大流行的H1N1為例,H1N1屬於A 型流感病毒,其病毒的基因是由人、鳥禽和豬的基因所組成。患有H1N1 的患者可能會有發燒、頭痛、全身性肌肉痠痛、咳嗽、喉嚨痛和鼻塞的症狀。而這種高度傳染的病毒有曾被世界衛生組織發出等級6的流行病警告。

由於病毒的高度抗原漂變(Antigenic drift )的能力,讓流感疫苗的效果有限。除此之外,病患若是同時感染兩種病毒,而使的不同病毒之間發生基因的片段重組(antigenic shift),使的在2009年發現了新型的病毒變種,而造成流感大流行。

Oseltamivir (奧司他偉,俗稱克流感)是其中一種針對H1N1的神經氨酸酶(Neurminidase, 簡稱NA,主要功能是幫助新生成的病毒脫離被感染的宿主細胞)有效抑制活性的藥物。而A 型流感病毒具有Antigenic drift和antigenic shift的特性,在神經氨酸酶基因發生突變,所以在2007-2008年,雖然只發現少數的對克流感有抗藥性的 H1N1 病例,但而後發現之後的H1N1亞型流感有99.4% 幾乎都有抗藥性。

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腦脊髓液是直接與人類大腦或神經接觸的體液,所以在研究或臨床診斷神經性病變、中樞神經腫瘤、腦部創傷及腦膜炎等疾病時,皆會進一步探究腦脊髓液的內容物,若其中存有大量特殊蛋白、細菌、異常顏色或細胞,可協助醫師執行後續治療策略,在研究上,亦能輔助判斷疾病的致病機制。

目前已有許多研究利用次世代定序分析血漿內游離的miRNA,其具有潛力做為許多疾病的marker,本部落格在先前文章已有介紹。針對腦脊髓液內游離的miRNA,多數研究是利用qRT-PCR研究,例如在阿茲海默症有被發現miRNA表現情形與正常人不同,但較少利用次世代定序研究腦脊髓液的miRNA,此主因為每個病人一次取得的腦脊髓液有限,這些腦脊髓液含有的total RNA總量極為稀少,而miRNA又以極低量存在這些微量total RNA中,所以導致實驗執行上的困難。

Kasandra Lovette Burgos等科學家為突破此困難,首先,他們先找尋最適合萃取腦脊髓液游離RNA的試劑,其應符合高回收率、無RNA長度的限制及操作方便性,作者先以性質類似的血漿做為測試的樣品,比較各式萃取試劑的回收率,結果如下圖,在200 ul的腦脊髓液內,回收率較佳的試劑組為mirVana、PARIS mirVana、Qiagen miRNeasy及BiooPure,約能萃取到15 ng的total RNA。

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急性骨髓性白血症 Acute myeloid leukemia (AML) 通常是由於體細胞的基因突變所造成,尤其是早期進行造血作用 (hematopoiesis)stem cellmyeloid progenitor cell。而 FLT3  這個 receptor的異常在 AML 的形成中扮演著重要腳色,尤其是含有FLT3 ITD的病例在AML 中所佔的比例約有 20-30% 的高比例,其餘則是 point mutation 所造成的基因異常,例如在 D835

FLT3 基因在早期的造血細胞才會有比較高的表現量,它的位置在 13q12.2,含有 24exonORF2979 bps。而 FLT3 ITD是在其 juxtamembane domain 的位置有片段大小不一的 insertion (約在 exon 1415 之間) ,長度大約在 15-300不等。FLT3 ITD 會使的FLT3 在沒有 ligand 的情況下持續被活化,讓下游的PI3KRAS pathway 處於一個異常的狀態。FLT3的持續活化會造成細胞增生 (cell proliferation) 以及抑制細胞凋亡 (apoptosis),這也是血癌形成的主因。

 

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    自從 NGS 技術發展至今,已有無數的古老生物被進行定序,這些生物樣品可能來自數千年以前。為了進行定序,首先需要將這些受損或降解的 DNA 片段製備成可供 NGS 定序儀上機使用的 library,而製備的目的主要是讓 DNA 片段兩端接上人工合成的 adapter,一則可起始定序反應,一則可用作 PCR 增輻反應。目前製備的主流方式分為兩種:一種是 454 Life science 使用的 blund end ligation;另一種是 Illumina 使用 Y 型結構的 adapter 進行 A-T ligating,不論何種方式,均為雙股 DNA 的黏合反應,然而,在操作古老 DNA 時,這種製備流程可能會發生一些缺憾。

 

使用新的單股 DNA 來製備 NGS library,比較目前常見的方式具有以下的優點:

第一、製備過程中 DNA 標示上 biotin,因此純化的步驟使用 streptavidin-coated的磁珠,能減少樣品流失。

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Next Generation Sequencing 這個名稱是相較於傳統定序技術而言。

傳統的定序技術包括:

  • Chemical Sequencing
  • Sanger Sequencing

 

一般見到「傳統定序技術」大部份是指 Sanger 的定序方法。

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