Selected Category: 次世代定序 (20)

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    定序技術不斷推陳出新,自諾貝爾化學獎得主Frederick Sanger起,迄今核酸定序之成本、時間與技術,也逐年的縮短與降低。本篇主要介紹半導體對於定序的應用,其中喬納森羅斯伯格(Jonathan M. Rothberg)扮演著舉足輕重的角色,他是位專精於生物領域的發明兼企業家(圖一),同時也是454生命科學公司(454 Life Sciences)的創業者,成功研發焦磷酸測序技術(pyrosequencing),就在羅氏公司(Roche)併購了454生命科學公司的同年,他創立Ion Torrent公司,羅斯伯格本身亦是蘋果公司創辦人賈柏斯 (Steve Jobs) 的推崇者,因而IT Information technology角度捕捉靈感,進一步將半導體微晶片的概念,跨領域的導入定序技術中,不僅在基因定序領域中具有開創新穎性,其所創造的生技經濟效益,更被富比士財富雜誌評選為封面人物(圖二)

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為確保育種者的智慧財產權避免侵權事件、檢測作物是否為混合品種與協助追查農產品走私等皆需進行作物品種鑑定,因此良好的鑑定技術將有助於作物品種鑑定。

 

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自2005年Roche推出Roche/454 Genome Sequencer 20 System後,開啟了次世代定序的大門,經過不到10年的時間,第三世代的定序技術平台也問世了。本篇文章主要是介紹2010由Pacific Biosciences 公司發表的定序平台---PacBio RS,以及其定序原理---Single Molecule Real Time (SMRT) technology。

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近年來,生物技術發展多樣性,以及許多高分子材料(如:奈米粒子)的研究精進,其中更以『磁分離(Magnetic separation)』概念的純化機制,結合分生、物理與化學三者合一,具實驗獨特性。此技術涵蓋範圍廣泛,在核酸領域的應用方面,舉凡:poly-A mRNA的分離、DNA的純化與次代NGS定序,都有此技術參與其中,除此之外,也可應用於蛋白質純化,免疫學等用途。分生實驗過程的核酸分離和純化,會因目的性不同,而於帶磁性奈米粒子的表面,鑲嵌不一樣的配體(ligand),以利進行結合與親和的反應,常見例如:結合poly-A mRNAoligo-(dT)streptavidin等鑲嵌配體。這類型的實驗分離方式,泛稱為SPRISolid Phase Reversible Immobilisation)是一種固相-液相可逆化固定的分離純化技術,比起矽粒子(主要成分為SiO2)的分離更有效率,此項發明影響生命科學實驗的發展,有著舉足輕重的地位,亦逐漸成為現今NGS製備Library方面,於DNA的純化分離與分子量大小之篩選(size selection),不可或缺的一項工具,也是實驗步驟不可缺少的環節。

磁珠的發明構想與概念,最初由任教於挪威科技大學的化學家John Ugelstad 所研發製成,他在聚合物和膠體化學的領域貢獻甚多,也於1976年以聚苯乙烯(Polystyrene)為主要材質,製造出均勻磁化的球體粒子稱為Dynabeads® ,這也是影響日後生物實驗材料革命性的重大突破。

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A型流感病毒是人類最常感染的流行病毒 。以2009年發生大流行的H1N1為例,H1N1屬於A 型流感病毒,其病毒的基因是由人、鳥禽和豬的基因所組成。患有H1N1 的患者可能會有發燒、頭痛、全身性肌肉痠痛、咳嗽、喉嚨痛和鼻塞的症狀。而這種高度傳染的病毒有曾被世界衛生組織發出等級6的流行病警告。

由於病毒的高度抗原漂變(Antigenic drift )的能力,讓流感疫苗的效果有限。除此之外,病患若是同時感染兩種病毒,而使的不同病毒之間發生基因的片段重組(antigenic shift),使的在2009年發現了新型的病毒變種,而造成流感大流行。

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腦脊髓液是直接與人類大腦或神經接觸的體液,所以在研究或臨床診斷神經性病變、中樞神經腫瘤、腦部創傷及腦膜炎等疾病時,皆會進一步探究腦脊髓液的內容物,若其中存有大量特殊蛋白、細菌、異常顏色或細胞,可協助醫師執行後續治療策略,在研究上,亦能輔助判斷疾病的致病機制。

目前已有許多研究利用次世代定序分析血漿內游離的miRNA,其具有潛力做為許多疾病的marker,本部落格在先前文章已有介紹。針對腦脊髓液內游離的miRNA,多數研究是利用qRT-PCR研究,例如在阿茲海默症有被發現miRNA表現情形與正常人不同,但較少利用次世代定序研究腦脊髓液的miRNA,此主因為每個病人一次取得的腦脊髓液有限,這些腦脊髓液含有的total RNA總量極為稀少,而miRNA又以極低量存在這些微量total RNA中,所以導致實驗執行上的困難。

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急性骨髓性白血症 Acute myeloid leukemia (AML) 通常是由於體細胞的基因突變所造成,尤其是早期進行造血作用 (hematopoiesis)stem cellmyeloid progenitor cell。而 FLT3  這個 receptor的異常在 AML 的形成中扮演著重要腳色,尤其是含有FLT3 ITD的病例在AML 中所佔的比例約有 20-30% 的高比例,其餘則是 point mutation 所造成的基因異常,例如在 D835

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    自從 NGS 技術發展至今,已有無數的古老生物被進行定序,這些生物樣品可能來自數千年以前。為了進行定序,首先需要將這些受損或降解的 DNA 片段製備成可供 NGS 定序儀上機使用的 library,而製備的目的主要是讓 DNA 片段兩端接上人工合成的 adapter,一則可起始定序反應,一則可用作 PCR 增輻反應。目前製備的主流方式分為兩種:一種是 454 Life science 使用的 blund end ligation;另一種是 Illumina 使用 Y 型結構的 adapter 進行 A-T ligating,不論何種方式,均為雙股 DNA 的黏合反應,然而,在操作古老 DNA 時,這種製備流程可能會發生一些缺憾。

 

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心肌病(CVD)是指伴有心肌功能障礙的心肌疾病。這類心血管疾病各個國家中一直是罹病死亡的主要因素,在2005年在全世界約有30%的死亡人數(1700百萬)離病死亡。新聞常常看到有青壯年發生心臟性猝死。這些情況常常是突發的心悸、暈倒之後休克,較嚴重的可能會無預警的猝死;但是病患在平常是很難被診斷出來的。單光在歐洲,就有48%的人死於心血管疾病,也造成23%的醫療負擔。儘管現代醫療管理方面進步,像是CVD的預後、致病機制研究和尋找潛在治療方法仍非常重要。

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近幾年來肺癌成為前十大癌症死亡率最高,原因是現今社會中由於空氣汙染嚴重、二手菸或是因為工作關係長期處在於大型廢氣排放設備的工作區域等等,又加上肺臟本身沒有痛覺神經,所以當發現肺部有異狀時通常癌症已經轉移到淋巴或其他組織。

肺癌與其他癌症的治療方法不外乎就是化療、標靶等等,而近年來國內掀起一陣風潮,就是由基因定序來協助治療肺癌。在2010.09.14的中時健康網(http://health.chinatimes.com/contents.aspx?cid=6,60&id=11649)曾報導過,台北醫學大學附設醫院透過國內外文獻,推出全台首創肺癌基因定序篩檢,癌症患者只要透過基因篩檢就可以找到最適合自己的治療方式或是藥物使用,這樣一來不僅可以對症下藥還可以減少一些治療的時間。在國外早就在2008年Campbell等人在文獻中提利用全基因體定序協助肺癌的研究,接著分別在2010年與2011年陸陸續續都有相關的文獻出爐,如下表

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我們對於數位資訊儲存媒體的容量需求一直不斷地增加. 以硬碟容量而言, 30年前一顆數十MB, 到今日一顆數TB的硬碟, 儲存的密度可以說增加了數十萬倍. 即使有如此大的進步, 我們對於更大容量的儲存設備還是有需求.

 

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傳統中藥醫學(Traditional Chinese Medicines ,TCMs),於博大精深的中國已超過3000年載的使用歷史,隨著日新月異的醫學科技,訴求自然之傳統中醫業已與速效的西醫並駕齊驅,很多醫學觀念亦紛紛導向中西合璧之途,在各種醫學評估及試圖尋找西藥替代品的情況下,中草藥勢必為首選。而中藥產品的日益普及,與其接受度漸趨增加,也使得產值逐年水漲船高,消費者除了注意藥品安全問題外,亦衍生出藥物來源合法性之問題,但往往在選購中藥產品時,看見的只是包裝的成分內容,附註之藥品標籤是否誠實,亦或其中隱藏很多摻假不實的添加成分,皆無從得知,而消費者就可能成為這場交易中的蒙蔽者。甚至有不肖商人,利用違法的瀕臨絕種動植物為藥材,或添加禁止入藥之植物萃取物試圖魚目混珠,這些非法行為都可能導致消費者身體損害或後遺症。迄今,鑑識中藥內容方式,雖可鑑別出植物成分,但也侷限於已知標準品的範圍,欲知其確切來自何物種仍有難度,因此,要如何有效把關這些市面上流通的中藥產品,本篇作者將中藥檢驗結合次代定序 (NGS) 平臺,探究每種藥品中所含之 DNA 種類,將其序列與已知動植物之 DNA 資料庫進行比對,利用此方式作者成功鑑定出中藥成分的物種來源。此外,為了達到保護野生動植物的永續發展,也結合瀕臨絕種野生動植物國際貿易公約,探討這些中藥來源的合法性,作者分析由澳洲海關人員所查扣包含粉末、錠劑、膠囊與草藥等多種違反當地環境法之中藥製品 (圖一)

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基因的轉錄後調控常常發生在mRNA的3’UTR,近兩年許多團隊透過NGS技術來研究3’UTR的調控及演化,並發現了新的調控機制。以線蟲為例,由於線蟲大部分基因的3’UTR缺少註解,Calvin H.Jan 等人在2010年透過3P-Seq的方法將RNA尾巴位置透過NGS技術定序後,經分析發現高比例的A/U序列內容會促進線蟲基因體的壓縮 ( genome compaction ),因為造成切割的因子是A/U高比例的,也因此他們容易在A/U高比例的序列內容中出現。事實上30%的protein-coding基因有不同的mRNA型態 ( alternative mRNA isoform ),另外在尾巴距離很近但不同的切割位置以往都是被忽略掉的,作者發現大量的這種isoform可能是線蟲3UTR在演化上逐漸變短的中間物。甚至作者發現三分之一的匯聚基因對( convergent gene pair) 在3UTR重疊的地方,將具有正負股雙面功能的因子在序列上做回文的排列,這個現象節省了基因之間的距離,造成基因體的壓縮。雖然線蟲3UTR的長度只有哺乳動物的六分之一,但線蟲具有保留性miRNA位置的密度是哺乳動物的兩倍。部分是因為有更多類型的種子互補位置 ( seed complementary site ) 較傾向被保留。這些發現揭開了切割與多聚腺苷酸化對基因結構演化的影響,也提供了研究後轉錄基因調控的資源。

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NGS具有高輸出量的特性,而且不需經過bacterial cloning的過程,這兩種特性使得定序的成本大大得降低,至2010年底,以Illumina系統為例,定序成本,每1bp約只需要花費新台幣0.0002元,遠低於Sanger sequencing成本0.2元/bp。NGS所具有的高輸出量與高解析度特性,使其應用範圍也日趨廣泛,遍及基因體學、生物醫學、環境科學等研究 (上圖);而利用NGS 系統的研究論文也越來越多 (下圖 橘色線),數量呈現對數成長,反觀Microarray與QPCR,研究論文的數量已經趨近於飽和 (下圖 藍線與紫線),而利用Southern與Northern bolt的研究論文數量有下降的趨勢 (下圖 淡紫色線),這說明著NGS的時代已經到來,NGS技術已成熟且普及化,解決了從前的技術無法解決的難題。

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Illumina (Genome Analyzer)與Roche (454)皆是次世代定序儀(Next Generation Sequening , NGS ),兩者的基本原理離不開sanger的鏈終止定序法(chain termintin),但是卻有不同的定序原理。

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前列腺癌是美國癌症比例第二高的癌症,然而,前列腺癌細胞內發生的基因變異卻尚未被完全了解。直到近年次世代定序技術的蓬勃發展,科學家才得以解序癌細胞內的全基因體序列,進而深入探討前列腺癌細胞的癌化機制。

        Michael F. Berger等人在2011年二月發表在知名期刊natureThe genomic complexity of primary human prostate cancer”,其研究團隊以次世代定序平台GA2x解序七位罹患初期前列腺癌病患的癌細胞全基因體序列,研究發現前列腺癌細胞基因體有非常複雜的重組現象,如下圖,例如染色體21內,原本只會出現在紅色區域內的DNA序列卻出現在橘色區域中,而橘色區域的DNA片段也有轉移到紅色區域的情形,除此之外,不同染色體上的DNA片段也有相互交換的情形,例如正常細胞中僅會出現在第21對染色體之橘色區域的DNA序列,在癌細胞中出現在第1對染色體的黃色區域內。另外,下圖也顯示了在正常前列腺細胞內的基因體結構並沒有DNA片段位置轉移的現象。這些結果顯示前列腺癌細胞的基因體內,有著非常高頻率且複雜的重組現象(genomic rearrangements),並且這些重組現象與癌化過程有很大的相關性。

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(一)Illumina (Genome Analyzer)Sanger sequencing在定序前製作library過程中,是有極大差異的,最明顯的差異莫過於否需經過細菌進行質體複製。

前者(Illumina System就是指NGS)在製作library完全不需經過細菌進行質體複製就能直接進行定序,以減少錯誤發生率(如圖一)

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NGS是目前最新且高通量的定序方法,所謂的NGS是指傳統定序法的改良版,而傳統定序法可以分成兩種來說明之。

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距今十萬年前,尼安德塔人的足跡曾遍及歐洲, 亞洲西部以及西伯利亞,而約在三萬年前,尼安德塔人族群卻忽然消失殆盡,他們為何消失? 他們與現代人是否血緣關係? 這些謎團一直是人類學家們所好奇的問題。

Svante Paabo團隊從三個尼安德塔人的骨骼中萃取DNA (圖一),利用NGS系統將其基因體進行定序,獲得超過4Gb序列資料,將其序列資料與現代人進行分析比較後發現,亞洲, 歐洲以及巴布亞新幾內亞的現代人有百分1-4%的DNA來自於尼安德塔人,而非洲裔的現代人則沒有此現象;12個非非裔(non-Africans)現代人特有的序列中,就有10個是來自尼安德塔人,這暗示著非非裔(non-Africans)的現代人祖先與尼安德塔人有雜交的現象;然而這樣的結果,與1997年Svante Paabo團隊的分析結果相左,主要是因為當時並沒有進行全基因體的比對,單單比對粒線體上的DNA,而粒線體DNA只占人類基因體的極小部分,因此,無法呈現全貌,沒有證據顯示現代人與尼安德塔人的關係;如今,定序技術的進步,使的尼安德塔人的序列得以被完整解開,進而證實非非裔的現代人皆有尼安德塔人的血統存在,這樣的結果已經改寫了人類的演化史。

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Next Generation Sequencing 這個名稱是相較於傳統定序技術而言。

傳統的定序技術包括:

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