目前分類:次世代定序NGS (28)

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作者:張美虹/ 有勁生物科技

 

群集分析( cluster analysis )主要目的是將一大筆資料精簡成少數幾個同質性次群體( homogeneous subgroups ),以便從雜亂無章的一大堆原始資料中,做到分類、分群的目標。

 

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作者:林志鵬/有勁生物科技

 

有勁生物科技股份有限公司 (Yourgene Bioscience),成立於2010年,是台灣一間同時擁有國際認證的基因體核心實驗室與專業生物資訊部門的生技公司。本公司擁有Illumina 及 Ion Torrent 兩大定序平台與相關定序設施,且基因體核心實驗室的定序技術更是獲得Illumina Certified Service Provider與Ion AmpliSeq™ Exome Certified Service之認證,更在2016年底以股權交換和現金,合計720萬英鎊(約合新台幣2.7億元)被英國上市公司Premaitha Health收購。此外,實驗室也獲得了ISO 17025 認證並參加CAP舉辦的能力試驗,擁有最可靠與最標準化之操作定序技術。

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NGS技術中,降低錯誤率一直是很重要的一個環節。尤其是在癌症領域、法醫鑑定、遠古生物的基因體學、cell free DNA應用、metagenomics應用等領域,目標就是要正確地偵測到頻率很低的變異點位。也因此在實驗方法上如果會造成非特異性的錯誤率太高,就會無法正確的將非常稀有的變異點位找出來,這樣的點位會淹沒在非特異錯誤之中。

在2012年,Quail, M. et al. 曾經測試了當時各種定序平台的錯誤率,在當時,illumina 定序平台之隨機錯誤率基準值在0.1~0.5% 之間,而其他定序平台則在>1%。然而經過3年的時間,各家定序平台都推出了新版本的反應試劑,像是Ion Torrent 系統推出了Hi-Q定序試劑,Illumina 系統推出了SBS kit V2。這些定序試劑藉由更改化學配方與反應酵素,嘗試著降低各種可能的錯誤。在2015年,尚未有看到詳盡的新版本評比資訊,但隨著不同廠商不同機種的持續推出,可以期待未來在定序機台本身會有更好的表現。

 

High fidelity PCR enzyme

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Ion S5 五大特點

科技始終來自於人性,基因探索解開生命謎題,隨著科技的發展,很多人性化的設計於是乎一一的成形,造就許多劃時代的發明,最顯著的例子就是智慧型科技產品,把電腦結合手機,改變世界流行。次世代定序(Next Generation SequencingNGS)隨著生技與資訊潮流的演進,更是將儀器整併,發展成實驗室的桌上型,Ion Torrent 研發『Ion S5』新一代的定序儀,以簡單操作為前提,讓生技耳目一新,本公司也接軌NGS最新訊息,2015年第4季也率先引進,兼顧定序品質與效率,目的為向上提升與更新,讓您獨步NGS的生技流行。

Ion S5』提供五大定序特點,如下所敘:

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在2013年底,Nature Method 期刊將單細胞定序選為年度技術。在發育生物學、腫瘤基因體學、生殖醫學等領域,單細胞定序技術已經開始發揮它的威力,為我們帶來許多珍貴的訊息。本篇主要著重於此技術在當前的現況,介紹目前的單細胞分離技術、放大技術、與一些應用的面向。第一部分將先介紹技術的部份,第二部分將整理一些已發表的應用情形。

單細胞定序的流程,大概可分為1. 單細胞分離,2.依照不同的需求放大樣本進行定序。可以參考圖一。

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 圖一 單細胞定序的流程(圖片來源: Single-cell sequencing Vol.11 No.1 | JAN 2014 |Nature Methods)

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    定序技術不斷推陳出新,自諾貝爾化學獎得主Frederick Sanger起,迄今核酸定序之成本、時間與技術,也逐年的縮短與降低。本篇主要介紹半導體對於定序的應用,其中喬納森羅斯伯格(Jonathan M. Rothberg)扮演著舉足輕重的角色,他是位專精於生物領域的發明兼企業家(圖一),同時也是454生命科學公司(454 Life Sciences)的創業者,成功研發焦磷酸測序技術(pyrosequencing),就在羅氏公司(Roche)併購了454生命科學公司的同年,他創立Ion Torrent公司,羅斯伯格本身亦是蘋果公司創辦人賈柏斯 (Steve Jobs) 的推崇者,因而IT Information technology角度捕捉靈感,進一步將半導體微晶片的概念,跨領域的導入定序技術中,不僅在基因定序領域中具有開創新穎性,其所創造的生技經濟效益,更被富比士財富雜誌評選為封面人物(圖二)

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(圖一)

 

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為確保育種者的智慧財產權避免侵權事件、檢測作物是否為混合品種與協助追查農產品走私等皆需進行作物品種鑑定,因此良好的鑑定技術將有助於作物品種鑑定。

 

近年來國內已有多個單位透過簡單重複序列分子標誌多型性分析進行作物品種鑑定,以下針對簡單重複序列進行相關說明:

簡單重複序列 (simple sequence repeat) 簡稱SSR,又可稱為微衛星序列 (microsatellite),是一種以2~6個核苷酸為一個 motif 的重複性序列,普遍存在於所有原核與真核生物基因體 (genome) 中。簡單重複序列於單一基因座 (single locus) 具有多重對偶基因 (multiple alleles) 與共顯性 (codominance) 遺傳的特性,此外簡單重複序列motif發生突變的機率相較於基因體的其他區域高,促使簡單重複序列於每個個體間存在著高度的變異性進而造就簡單重複序列成為鑑別度良好的分子標誌。

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自2005年Roche推出Roche/454 Genome Sequencer 20 System後,開啟了次世代定序的大門,經過不到10年的時間,第三世代的定序技術平台也問世了。本篇文章主要是介紹2010由Pacific Biosciences 公司發表的定序平台---PacBio RS,以及其定序原理---Single Molecule Real Time (SMRT) technology。

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Figure 1. Zero-mode wave-guides (ZMWs) – small well-like containers & SMRT Cell & PacBio RS (擷取自http://smrt.me d.cornell.edu/FAQs.html)

 

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近年來,生物技術發展多樣性,以及許多高分子材料(如:奈米粒子)的研究精進,其中更以『磁分離(Magnetic separation)』概念的純化機制,結合分生、物理與化學三者合一,具實驗獨特性。此技術涵蓋範圍廣泛,在核酸領域的應用方面,舉凡:poly-A mRNA的分離、DNA的純化與次代NGS定序,都有此技術參與其中,除此之外,也可應用於蛋白質純化,免疫學等用途。分生實驗過程的核酸分離和純化,會因目的性不同,而於帶磁性奈米粒子的表面,鑲嵌不一樣的配體(ligand),以利進行結合與親和的反應,常見例如:結合poly-A mRNAoligo-(dT)streptavidin等鑲嵌配體。這類型的實驗分離方式,泛稱為SPRISolid Phase Reversible Immobilisation)是一種固相-液相可逆化固定的分離純化技術,比起矽粒子(主要成分為SiO2)的分離更有效率,此項發明影響生命科學實驗的發展,有著舉足輕重的地位,亦逐漸成為現今NGS製備Library方面,於DNA的純化分離與分子量大小之篩選(size selection),不可或缺的一項工具,也是實驗步驟不可缺少的環節。

磁珠的發明構想與概念,最初由任教於挪威科技大學的化學家John Ugelstad 所研發製成,他在聚合物和膠體化學的領域貢獻甚多,也於1976年以聚苯乙烯(Polystyrene)為主要材質,製造出均勻磁化的球體粒子稱為Dynabeads® ,這也是影響日後生物實驗材料革命性的重大突破。

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A型流感病毒是人類最常感染的流行病毒 。以2009年發生大流行的H1N1為例,H1N1屬於A 型流感病毒,其病毒的基因是由人、鳥禽和豬的基因所組成。患有H1N1 的患者可能會有發燒、頭痛、全身性肌肉痠痛、咳嗽、喉嚨痛和鼻塞的症狀。而這種高度傳染的病毒有曾被世界衛生組織發出等級6的流行病警告。

由於病毒的高度抗原漂變(Antigenic drift )的能力,讓流感疫苗的效果有限。除此之外,病患若是同時感染兩種病毒,而使的不同病毒之間發生基因的片段重組(antigenic shift),使的在2009年發現了新型的病毒變種,而造成流感大流行。

Oseltamivir (奧司他偉,俗稱克流感)是其中一種針對H1N1的神經氨酸酶(Neurminidase, 簡稱NA,主要功能是幫助新生成的病毒脫離被感染的宿主細胞)有效抑制活性的藥物。而A 型流感病毒具有Antigenic drift和antigenic shift的特性,在神經氨酸酶基因發生突變,所以在2007-2008年,雖然只發現少數的對克流感有抗藥性的 H1N1 病例,但而後發現之後的H1N1亞型流感有99.4% 幾乎都有抗藥性。

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腦脊髓液是直接與人類大腦或神經接觸的體液,所以在研究或臨床診斷神經性病變、中樞神經腫瘤、腦部創傷及腦膜炎等疾病時,皆會進一步探究腦脊髓液的內容物,若其中存有大量特殊蛋白、細菌、異常顏色或細胞,可協助醫師執行後續治療策略,在研究上,亦能輔助判斷疾病的致病機制。

目前已有許多研究利用次世代定序分析血漿內游離的miRNA,其具有潛力做為許多疾病的marker,本部落格在先前文章已有介紹。針對腦脊髓液內游離的miRNA,多數研究是利用qRT-PCR研究,例如在阿茲海默症有被發現miRNA表現情形與正常人不同,但較少利用次世代定序研究腦脊髓液的miRNA,此主因為每個病人一次取得的腦脊髓液有限,這些腦脊髓液含有的total RNA總量極為稀少,而miRNA又以極低量存在這些微量total RNA中,所以導致實驗執行上的困難。

Kasandra Lovette Burgos等科學家為突破此困難,首先,他們先找尋最適合萃取腦脊髓液游離RNA的試劑,其應符合高回收率、無RNA長度的限制及操作方便性,作者先以性質類似的血漿做為測試的樣品,比較各式萃取試劑的回收率,結果如下圖,在200 ul的腦脊髓液內,回收率較佳的試劑組為mirVana、PARIS mirVana、Qiagen miRNeasy及BiooPure,約能萃取到15 ng的total RNA。

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急性骨髓性白血症 Acute myeloid leukemia (AML) 通常是由於體細胞的基因突變所造成,尤其是早期進行造血作用 (hematopoiesis)stem cellmyeloid progenitor cell。而 FLT3  這個 receptor的異常在 AML 的形成中扮演著重要腳色,尤其是含有FLT3 ITD的病例在AML 中所佔的比例約有 20-30% 的高比例,其餘則是 point mutation 所造成的基因異常,例如在 D835

FLT3 基因在早期的造血細胞才會有比較高的表現量,它的位置在 13q12.2,含有 24exonORF2979 bps。而 FLT3 ITD是在其 juxtamembane domain 的位置有片段大小不一的 insertion (約在 exon 1415 之間) ,長度大約在 15-300不等。FLT3 ITD 會使的FLT3 在沒有 ligand 的情況下持續被活化,讓下游的PI3KRAS pathway 處於一個異常的狀態。FLT3的持續活化會造成細胞增生 (cell proliferation) 以及抑制細胞凋亡 (apoptosis),這也是血癌形成的主因。

 

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    自從 NGS 技術發展至今,已有無數的古老生物被進行定序,這些生物樣品可能來自數千年以前。為了進行定序,首先需要將這些受損或降解的 DNA 片段製備成可供 NGS 定序儀上機使用的 library,而製備的目的主要是讓 DNA 片段兩端接上人工合成的 adapter,一則可起始定序反應,一則可用作 PCR 增輻反應。目前製備的主流方式分為兩種:一種是 454 Life science 使用的 blund end ligation;另一種是 Illumina 使用 Y 型結構的 adapter 進行 A-T ligating,不論何種方式,均為雙股 DNA 的黏合反應,然而,在操作古老 DNA 時,這種製備流程可能會發生一些缺憾。

 

使用新的單股 DNA 來製備 NGS library,比較目前常見的方式具有以下的優點:

第一、製備過程中 DNA 標示上 biotin,因此純化的步驟使用 streptavidin-coated的磁珠,能減少樣品流失。

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Next Generation Sequencing 這個名稱是相較於傳統定序技術而言。

傳統的定序技術包括:

  • Chemical Sequencing
  • Sanger Sequencing

 

一般見到「傳統定序技術」大部份是指 Sanger 的定序方法。

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心肌病(CVD)是指伴有心肌功能障礙的心肌疾病。這類心血管疾病各個國家中一直是罹病死亡的主要因素,在2005年在全世界約有30%的死亡人數(1700百萬)離病死亡。新聞常常看到有青壯年發生心臟性猝死。這些情況常常是突發的心悸、暈倒之後休克,較嚴重的可能會無預警的猝死;但是病患在平常是很難被診斷出來的。單光在歐洲,就有48%的人死於心血管疾病,也造成23%的醫療負擔。儘管現代醫療管理方面進步,像是CVD的預後、致病機制研究和尋找潛在治療方法仍非常重要。

 

CVD常常伴隨著高血壓、高類固醇和抽煙等危險因子,但是這些因子僅和部分遺傳疾病類型有關。於是開始有人將研究CVD發展機制的希望轉向遺傳學和基因體學,希望可以找到其他致病的相關因子。只是上述因子相互影響而無法確認相互關係。其中比較困難的是在一些家族遺傳疾病中所發現的對應遺傳證據也不一定和其臨近基因有直接的關係,更不用說去釐清遺傳因子和環境因子的相互影響的關係。  

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近幾年來肺癌成為前十大癌症死亡率最高,原因是現今社會中由於空氣汙染嚴重、二手菸或是因為工作關係長期處在於大型廢氣排放設備的工作區域等等,又加上肺臟本身沒有痛覺神經,所以當發現肺部有異狀時通常癌症已經轉移到淋巴或其他組織。

肺癌與其他癌症的治療方法不外乎就是化療、標靶等等,而近年來國內掀起一陣風潮,就是由基因定序來協助治療肺癌。在2010.09.14的中時健康網(http://health.chinatimes.com/contents.aspx?cid=6,60&id=11649)曾報導過,台北醫學大學附設醫院透過國內外文獻,推出全台首創肺癌基因定序篩檢,癌症患者只要透過基因篩檢就可以找到最適合自己的治療方式或是藥物使用,這樣一來不僅可以對症下藥還可以減少一些治療的時間。在國外早就在2008年Campbell等人在文獻中提利用全基因體定序協助肺癌的研究,接著分別在2010年與2011年陸陸續續都有相關的文獻出爐,如下表

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由上表中的main finding可得知,目前找到與肺癌相關的突變點已達到非常多,相信在未來全基因體定序不僅在於學術研究,而是更廣泛應用在臨床診斷與治療並且對於醫療方面會有加乘作用。

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我們對於數位資訊儲存媒體的容量需求一直不斷地增加. 以硬碟容量而言, 30年前一顆數十MB, 到今日一顆數TB的硬碟, 儲存的密度可以說增加了數十萬倍. 即使有如此大的進步, 我們對於更大容量的儲存設備還是有需求.

 

自從1988, 開始有人提出利用DNA作為儲存媒體的想法. 目前為止, 將資訊儲存於DNA上的資料量僅止於7,920位元(990位元組, bytes).  近年來由於NGS技術的發展, 使得DNA儲存媒體的技術也相對有很大的進步. 在最近一期的科學期刊, Church等人結合了NGS的技術, 將資料的儲存量提高到5.27百萬位元(相當於66萬位元組, 660 Kbytes), 約上一代技術660倍的增加.

 

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    次代定序( Next- generation sequencing, NGS ) 的技術自發展以來,應用層面相當之廣泛,舉凡:學術研究、醫學檢測、藥品查驗以及考古起源等,日新月異的定序技術發展之下,使得原本躓礙不前的考古科研有另一層突破性進展,本篇主旨探討利用NGS 巧妙的運籌帷幄,一窺歷史的跡象,揭開對古代生物迷思。古人曾云:「以史為鏡,可以知興替」。古老生物的遺傳密碼在NGS 抽絲剝繭下,間接了解生物演進,這些遠古的遺傳物質aDNA ( ancient DNA ) 經長年累月的歲月摧殘,會產生一些自發性的變異及損壞 ( 如:氧化、水解與 DNA crosslink ),或因外發性的降解 ( 如環境中的微生物所分泌核酸水解酵素,直接崩解 DNA 結構)。形成aDNA 三個主要特性:短片段、嘌呤丟失作用( depurination ) 與去胺基作用( deamination ) (Sawyer et al., 2012),亦在先前之『利用NGS觀察DNA降解現象』一文中,詳細敘述相關的發生過程及原理,但這些現象往往左右定序的正確性,容易造成鹼基配對錯誤 ( misincorporation 或稱 miscoding lesions ) 現象,導致產生錯誤的序列訊息,以下就由三方面的研究作介紹。

壹、遠古動物的研究方面:

    Stiller 等學者在 2006 年的研究,發現猛瑪象的 aDNA 序列,有以下現象:一、異類鹼基置換 ( transversion ):嘧啶與嘌呤間的置換,二、同類鹼基置換(transition):嘌呤之間或嘧啶之間的取代,造成定序的潛在誤配 (圖一),也因為有NGS的大量定序,顛覆研究古代基因組的模式,跳脫以往對於DNA的配對概念。另外,從時間角度來看,aDNA 的變化不易隨時間推移,而增加片段的瑣碎程度,Sawyer等學者觀察從幾十年一直到幾萬年的粒腺體DNA ( mitochondrial DNA, mtDNA ) 片段平均大小,研究發現似乎無太大差異,如紅點所示幾乎都集中分佈在40100 bp的片段範圍(圖二)

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傳統中藥醫學(Traditional Chinese Medicines ,TCMs),於博大精深的中國已超過3000年載的使用歷史,隨著日新月異的醫學科技,訴求自然之傳統中醫業已與速效的西醫並駕齊驅,很多醫學觀念亦紛紛導向中西合璧之途,在各種醫學評估及試圖尋找西藥替代品的情況下,中草藥勢必為首選。而中藥產品的日益普及,與其接受度漸趨增加,也使得產值逐年水漲船高,消費者除了注意藥品安全問題外,亦衍生出藥物來源合法性之問題,但往往在選購中藥產品時,看見的只是包裝的成分內容,附註之藥品標籤是否誠實,亦或其中隱藏很多摻假不實的添加成分,皆無從得知,而消費者就可能成為這場交易中的蒙蔽者。甚至有不肖商人,利用違法的瀕臨絕種動植物為藥材,或添加禁止入藥之植物萃取物試圖魚目混珠,這些非法行為都可能導致消費者身體損害或後遺症。迄今,鑑識中藥內容方式,雖可鑑別出植物成分,但也侷限於已知標準品的範圍,欲知其確切來自何物種仍有難度,因此,要如何有效把關這些市面上流通的中藥產品,本篇作者將中藥檢驗結合次代定序 (NGS) 平臺,探究每種藥品中所含之 DNA 種類,將其序列與已知動植物之 DNA 資料庫進行比對,利用此方式作者成功鑑定出中藥成分的物種來源。此外,為了達到保護野生動植物的永續發展,也結合瀕臨絕種野生動植物國際貿易公約,探討這些中藥來源的合法性,作者分析由澳洲海關人員所查扣包含粉末、錠劑、膠囊與草藥等多種違反當地環境法之中藥製品 (圖一)

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病毒在生物界扮演著舉足輕重的地位,幾乎所有的生物都能被特定的病毒所感染。而昆蟲同樣對於生物界以及人類非常重要,保護對人類有益的昆蟲,以及研究傳播病害的昆蟲是非常重要的事,例如:保障蜜蜂以及幼蠶的健康、探究疾病媒介昆蟲的帶毒,或是利用病毒製作生物性殺蟲劑等等,都是科學家們努力研究昆蟲病毒的目的。

   在過去,科學家們已花了許多時間研究昆蟲體內所帶的病毒種類,然而,並非所有的病毒都能夠被傳統的實驗技術所偵測到,過去常用在研究昆蟲病毒的技術包括了:直接觀察的TEM、血清學的ELISA、以核酸雜合為主的Southern、Northern blot,也有人直接分析 EST Library 的序列,找出新的病毒,不過這會受限在病毒濃度高的狀況下,後期常見有人使用 Microarray 技術監測如蜜蜂族群的帶毒率,但這項技術受限在只能偵測已知的病毒種類。

   如今,結合上新的次代定序系統,許多在蟲體內的微量病毒都陸續的在過去五年間被檢測到。由於次代定序系統有著快速、相對傳統實驗方式價廉的優點,以及可獲得高通量和正確性高的序列資料,因此即使看不出病徵的染病昆蟲,都能夠被有效的被偵測出微量的帶毒,所以次代定序系統可被用來當作一種監測病毒感染節肢動物們的有利工具。在製備 DNA 或是 RNA 材料時有兩種選擇,可以直接使用所有樣品的核酸製備,或是純化出病毒顆粒後再萃取核酸,後者的好處是可以避免掉寄主核酸的汙染,不僅如此,寄主進食食物上的病毒、還有被導入寄主基因體的病毒基因,都可以避免以減少誤判的可能性。

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