者:吳上豪/有勁生物科技

 

次世代定序問世已超過十年,許多不同定序原理的平台系統陸續推出。有勁生技提供Illumina與Ion Torrent系統的定序服務,相信許多人會有個疑問:不同平台系統是否會影響定序分析的結論呢?本文將引用2017年8月份發表在BMC Genomics的文獻,比較Illumina HiSeq 2500與Ion Torrent Proton的RNA定序能力與結果。

 

這篇文獻中,作者分別抽取正常小鼠及被藥物注射的小鼠RNA,按照Illumina與Ion Torrent上機需求建立基因文庫後,使用Illumina HiSeq 2500與Ion Torrent Proton機台進行定序。定序完成後,將序列以3種軟體 (GSNAP、STAR、STAR+Bowtie2)分別進行比對找出對應的基因,再比較Illumina與Ion Torrent兩平台各別找出的基因讀數、藥物注射前後有基因表現量變化的基因總數,並分析這些基因的功能以推論實驗結論的異同。

 

作者把在過半數小鼠中可被任一種軟體比對出至少5次的基因定義為「有表現的基因」,再將兩平台各自得到的有表現基因讀數經標準化計算後畫出散布圖,由圖一可觀察到多數基因的讀數在兩平台間的比值都接近1。若分別將兩平台找到的所有基因依照讀數多到少排名後計算Spearman相關係數,每隻小鼠得到的相關係數皆超過0.9;這結果顯示Ion Torrent與Illumina兩平台的基因偵測能力不相上下。

 

 

圖一、不同定序平台與序列比對軟體組合所得基因讀數分布圖

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一個點代表一個有表現的基因,將各組合得到的讀數標準化後取log值。X軸為Illumina系統得到的讀數,Y軸為Ion Torrent系統得到的讀數。結果顯示多數基因的讀數在兩平台間的比值都接近1。(Lahens, N.F. et al. BMC Genomics. 2017; 18(1):602.)

 

 

接下來是比較藥物注射前後表現量有顯著差異的基因數量,作者將兩系統所得到的結果畫成文氏圖呈現(見圖二)。各平台找到的基因當中,互有76-81%也可被另一平台找出。對於那些只能被其中一種平台找出的基因,作者觀察發現其在藥物注射前後的基因表現,差異倍率接近顯著差異的定義門檻,因此推論這些基因之所以在另一平台表現量未見顯著差異,可能是由於該基因本身表現量較低、或受到演算分析方式影響所造成。

 

 

圖二、不同定序平台與序列比對軟體組合所得藥物注射後表現量有差異的基因數量(文氏圖)

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黃色區域為僅被Illumina找到的基因 (Illumina specific gene),藍色區域為僅被Ion Torrent找到的基因 (Ion Torrent specific gene),紫色區域代表兩平台的共同結果。各區域中的數字標示表現量有差異的基因數量。(Lahens, N.F. et al. BMC Genomics. 2017; 18(1):602.)

 

 

作者針對不同定序系統與序列分析軟體組合篩選出表現量有明顯差異的基因,使用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)軟體分析這些基因的功能。圖三列出了這些基因由各「平台與序列比對軟體組合」所分析出的前6大功能,結果發現所有組合得到的主要功能都與發炎反應相關;由此作者認為平台與序列比對軟體的配對選擇對結論影響不大。

 

 

圖三、藥物注射後表現量有差異的基因之功能性分析結果

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由左至右是不同定序平台及序列比對軟體的組合,由上而下是分析結果中比對到的基因數量排名。不同顏色的色塊標示基因的功能性質。(Lahens, N.F. et al. BMC Genomics. 2017; 18(1):602.)

 

從以上Illumina和Ion Torrent平台的RNA定序結果看來,多數基因在兩平台皆可得到相近的讀數,小鼠在藥物注射前後表現量有差異的基因與這些基因功能的分析上也能得到相近的結論。不過作者也觀察到定序平台與序列比對軟體的組合仍對部分基因的定序結果有所影響,因此當您預測有顯著表現量差異的目標基因,定序後發現無顯著變化時,應特別留意觀察該目標基因的表現量差異倍率是否接近您所設的門檻,以及該基因進行序列比對的覆蓋率,並謹慎選用適當的序列比對軟體,才能得到最佳結果。

 

 

參考資料

Lahens, N.F. et al. A comparison of Illumina and Ion Torrent sequencing platforms in the context of differential gene expression. BMC Genomics. 2017 Aug 10; 18(1):602. doi: 10.1186/s12864-017-4011-0. (https://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12864-017-4011-0)

 

 

 

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