在今年五月的部落格” 基因體註解(genome annotation)面面觀 ─ 淺談KEGG資料庫”中，介紹到基因註解的粗略概念和簡介KEGG資料庫。在本篇部落格，我們將繼續介紹如何使用KEGG資料庫以及其他蛋白質交互作用資料庫。
上圖為該網站的首頁(http://www.kegg.jp/kegg/)
當我們拿到龐大的次世代定序資料，這些資訊經過序列組裝(De novo assembly)和基因預測後，可以得知某特定物種的基因序列，然而，這些序列需要經過註解才能推測其生物功能。在此篇部落格我們將介紹利用KEGG的網站服務BLAST來註解有興趣的基因序列。
不久前炒得沸沸揚揚的社會新聞，「麥當勞驅趕唐氏症者」這個斗大的新聞標題，不僅震懾社會大眾，而且引發國內民眾高度的關注，由此事件讓大家重新審視唐氏症於社會上的待遇與生活情況。唐氏症（Down syndrome）這個名詞其實大家應該不陌生，最初由John Langdon Down 醫生，於1866 年首次發表此相關外表徵狀；接著在1959 年，由Jerome Lejeune 等遺傳學者發現該症狀是由於染色體缺陷所造成。所謂的唐氏症，簡言之，就是精或卵於減數分裂時所產生的非單套異常，使原本兩兩配對的23 對染色體(包含性染色體XX 與XY)，其中第21 對染色體有三條染色體的不成雙配對現象（即trisomy 21），造成細胞有46+1 條之染色體異常病變，這種患者會伴隨智能障礙等現象，唐寶寶的照料其實會對家屬造成終其一生的心理與經濟之負擔。因此，如何在懷孕初期預防此種染色體異常的胎兒出生，無論是對家庭或是社會，無一是正面的消息。
其實生殖醫學的進步皆有脈絡可循，追溯歷史沿革的演進過程，自1947 年首次在血液中發現游離核酸（Cell-free DNA，cfDNA）之存在以來，直至1997 年，此項發現才開始漸趨應用在醫學方面，並且首次研究懷孕母親血漿內含有胎兒之游離核酸（cell-free fetal DNA，cffDNA），這項劃時代的發現，在胎兒醫學上儼然成為矚目的未來之星。近幾年，隨著次代定序（Next generation sequencing，NGS）的技術發展不斷突飛猛進，更加速cffDNA 的研究進展與醫學應用性。直接影響所及，即為可利用無創性且低風險的方式（如：抽血等）獲取懷孕母親的cffDNA，進而利用NGS 定序搭配生物資訊的分析，初步比對胎兒在第21 對染色體上，其是否有造成唐氏症之不成對疑慮(圖一)，藉此也可大幅降低羊膜穿刺的醫療行為所造成較高風險之產檢。除此之外，Swanson 等學者整理不同實驗室之研究數據，這些報導皆針對35 至40 歲高齡產婦的對象，於其懷孕3 至4 個月期間抽取cffDNA，利用NGS 技術進行定序，進行關於染色體所造成遺傳疾病之相關研究，比較四個不同研究團隊的實驗結果均顯示，對偵測染色體數目異常之敏感度（sensitivity）與專一性（specificity）皆有相似之處，意味著利用 NGS 進行非侵入性的產前檢查，也具有相當程度的可靠性。利用此項NGS 技術，除可觀察到 trisomy 21 導致的唐氏症外，其他在醫學同屬常見之遺傳症狀—染色體不成對（Aneuploidy），如：trisomy 18 導致艾德華氏症（Edwards syndrome）、trisomy 13 導致巴陶氏症（Patau syndrome）及透納氏症（monosomy X）等，也可透過次代定序的技術，檢測出這些可能造成胎兒不正常的遺傳疾病(表一)，這項新一代之定序技術發展及推廣，不僅將會是未來產檢的趨勢，且於國內外皆已廣泛宣傳推行，並逐步被民眾接受與採納。
隨著 NGS 技術演進，這項越來越成熟的技術慢慢促進許多領域的發展及快速成長，包括人類發展學、基因表現及調控、基因變異學及年齡與衰老相關研究等，未來更有可能影響醫藥、健康看護、疾病預防及臨床醫藥治療等領域發展。
樣品製備成 library 提供 NGS 上機在這項技術占有很重要的地位，目前在操作 whole genomic DNA library 時，首先需要面對的問題是如何將 genomic DNA 片段化至適當的大小，並且必須盡可能使斷點隨機及減小 DNA 受損程度。目前常見的方式是使用物理性的超音波震碎，例如：Covaris、Biorupter，或是使用液態壓力將分子截斷，例如：Hydroshear，除此之外，尚有使用特殊酵素 (fragmentase) 切斷 DNA 的方式及 transposon 插斷 DNA 的方式。
微波爐加熱應用在實驗室工作上並不少見，它被使用在促進細胞裂解、加速化學反應，微波爐的放射線被應用在增加酵素裂解蛋白質反應速度，然而應用在處理核酸裂解方面目前則從未被實驗過，若能控制得並再現性高，想必可以同時擁有減少實驗時間及同時處理大量樣品兩項優點。
微波爐的DNA 的片段化實驗以以下方式來進行，調整不同溫度及時間測試 genomic DNA 的變化，而常見的 Covaris 超音波震碎法以及較少見的高溫處理法被用來當作此項實驗的對照組，處理後以洋菜膠體電泳方式確認 DNA 分子大小分布。隨後，依照 Roche 454 library 製備標準流程建構 library，在 ligation 後的產物，使用 Bio-Rad real-time PCR 試劑分析並且同時放大總量，純化後再以 Agilent 2100 bioanalyzer 自動電泳觀察 library 分子量大小，最後以 Roche 454 pyrosequencing 系統上機定序及後續軟體分析數據。
在靜宜大學基因體研究中心的主持下，結合有勁生技公司與中山醫大、清華大學、香港大學、元培科技大學、中華大學等大學共同研發建置「牙周病整體基因體學分析平台」，藉由基因體定序與分析來建置台灣人牙周病原菌群資料庫，從基因及臨床資料變化，找病因、篩檢及防治技術，並對症開發新藥，未來將朝向農業生技與環境檢驗等多角化發展！
賀有勁生物科技與澳洲墨爾本大學合作，於2013年6月28日再度獲得澳洲國科會(Australian Research Council) 計畫, 總金額 1,450萬。
本計畫將會結合基因體學，與生物資訊來研究食物中寄生蟲並找出可能的治療對策。
腦脊髓液是直接與人類大腦或神經接觸的體液，所以在研究或臨床診斷神經性病變、中樞神經腫瘤、腦部創傷及腦膜炎等疾病時，皆會進一步探究腦脊髓液的內容物，若其中存有大量特殊蛋白、細菌、異常顏色或細胞，可協助醫師執行後續治療策略，在研究上，亦能輔助判斷疾病的致病機制。
目前已有許多研究利用次世代定序分析血漿內游離的miRNA，其具有潛力做為許多疾病的marker，本部落格在先前文章已有介紹。針對腦脊髓液內游離的miRNA，多數研究是利用qRT-PCR研究，例如在阿茲海默症有被發現miRNA表現情形與正常人不同，但較少利用次世代定序研究腦脊髓液的miRNA，此主因為每個病人一次取得的腦脊髓液有限，這些腦脊髓液含有的total RNA總量極為稀少，而miRNA又以極低量存在這些微量total RNA中，所以導致實驗執行上的困難。
Kasandra Lovette Burgos等科學家為突破此困難，首先，他們先找尋最適合萃取腦脊髓液游離RNA的試劑，其應符合高回收率、無RNA長度的限制及操作方便性，作者先以性質類似的血漿做為測試的樣品，比較各式萃取試劑的回收率，結果如下圖，在200 ul的腦脊髓液內，回收率較佳的試劑組為mirVana、PARIS mirVana、Qiagen miRNeasy及BiooPure，約能萃取到15 ng的total RNA。
NGS不僅可以協助物種解序更可以幫助癌症研究與臨床應用，就如下圖所顯示的有RNA-seq與ChIP- seq …..等等，提供更多訊息來瞭解cancer genome與設計出個人化的治療。
在癌症研究方面，在過去幾年中，NGS對於癌症研究不只扮演提供新的遺傳變異的角色，更得到癌症生成與轉移的複雜性之瞭解。使用NGS做研究的癌症種類有乳癌與直腸癌 .....等等。如下表
急性骨髓性白血症 Acute myeloid leukemia (AML) 通常是由於體細胞的基因突變所造成，尤其是早期進行造血作用 (hematopoiesis) 的stem cell 和 myeloid progenitor cell。而 FLT3 這個 receptor的異常在 AML 的形成中扮演著重要腳色，尤其是含有FLT3 ITD (Fms-like Tyrosine Kinase-3 Internal Tandem Duplication)的病例在AML 中所佔的比例約有 20-30% 的高比例，其餘則是 point mutation 所造成的基因異常，例如在 D835。
FLT3 基因在早期的造血細胞才會有比較高的表現量，它的位置在 13q12.2，含有 24 個exon， ORF是2979 bps。而 FLT3 ITD是在其 juxtamembane domain 的位置有片段大小不一的 insertion (約在 exon 14到15 之間) ，長度大約在 15-300不等。FLT3 ITD 會使的FLT3 在沒有 ligand 的情況下持續被活化，讓下游的PI3K 和 RAS pathway 處於一個異常的狀態。FLT3的持續活化會造成細胞增生 (cell proliferation) 以及抑制細胞凋亡 (apoptosis)，這也是血癌形成的主因。
RNA病毒是許多重要疾病的致病源，包含AIDS、流感、SARS等造成大眾健康威脅的疾病。常用標準的檢驗方式，仍需要依靠已知的核酸序列或者蛋白質抗原資訊來完成檢驗確認；近年來次世代定序技術發展快速，可應用於新興未知的病毒鑑定，然而真正應用於臨床上仍有其困難點，由臨床樣品抽取得到的核酸量通常很低且品質很差，並且包含大量非感染源的核酸，會造成分析上的困難，無法正確de novo出真正病原的genome。
本篇研究[1]以愛滋病毒(HIV)、西尼羅病毒(West Nile virus)以及呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus)作為樣品測試，在實驗部分使用SPIA(single-primer isothermal linear amplification)的技術放大核酸，在生物資訊分析的部分使用VICUNA組裝程式，將上述三組病毒，原始核酸總量介於femtograms到attograms之間，成功組裝出其完整的”基因序列”；此研究開啟了NGS實際應用於臨床檢驗的大門，對於未來可能發生的新興病毒檢測，有極大的助益。
SPIA技術由Nurith Kurn等人於2005年[2]所發展，此技術價值在於可以保留真實核酸組成的profile前提下，放大核酸總量達萬倍以上(picogram total RNA to several microgram cDNA，Ovation®
RNA-Seq System V2)。原理如下圖：
隨著定序技術不斷的創新，就算是定序人類基因體也不再是難事。當越來越多基因體定序資料的產生，在有限的經費下，如何大規模且有效地註解基因也越來越受到重視。
圖一、代表物種的基因體和基因大小
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