定序技術不斷推陳出新，自諾貝爾化學獎得主Frederick Sanger起，迄今核酸定序之成本、時間與技術，也逐年的縮短與降低。本篇主要介紹半導體對於定序的應用，其中喬納森•羅斯伯格（Jonathan M. Rothberg）扮演著舉足輕重的角色，他是位專精於生物領域的發明兼企業家(圖一)，同時也是454生命科學公司（454 Life Sciences）的創業者，成功研發焦磷酸測序技術（pyrosequencing），就在羅氏公司（Roche）併購了454生命科學公司的同年，他創立Ion Torrent公司，羅斯伯格本身亦是蘋果公司創辦人賈柏斯 (Steve Jobs) 的推崇者，因而從IT （Information technology）角度捕捉靈感，進一步將半導體微晶片的概念，跨領域的導入定序技術中，不僅在基因定序領域中具有開創新穎性，其所創造的生技經濟效益，更被富比士財富雜誌評選為封面人物(圖二)。
(圖一)
實驗上，我們時常使用 Polymerase Chain Reaction (PCR) 這項技術增幅目標核酸片段，這在建構NGS gDNA 或cDNA library時亦是其中重要的一環，然而實際上，進行 PCR 會因為兩種現象而機率性地產生非預期的結果：第一、在增幅過程中，片段小的 template 會傾向較容易地被放大；第二、經 PCR產生的產物有部分序列相似時，它們會在 annealing 的步驟中發生部份的雜合配對，而在extension 的步驟被 polymerase 延長，進而產生 chimeric副產物。此外，PCR 的過程中有時會伴隨 primer extension 不完整的產物產生，這樣的產物會在前述的部分配對中，在下一個 PCR cycle 繼續的被延長，但產生大小不一的 chimeric副產物。眾多的 PCR protocol 考量到上述現象，會適當地調整步驟，例如：提高 DNA模板的濃度或是降低 PCR 的 cycle 數，然而，當面對模板 DNA 極微量的情況時，就很難避免 PCR cycle 數的增加，而提高 chimera 出現的風險 (圖一、左)。
針對上述傳統 PCR 的弱點，新式的 PCR 方式被開發出現，利用油水不互溶的特性，製作出許多微小的水滴散布在油類溶液環境中，各種序列不同的模板 DNA 分子被隔離分開至各水滴中，每個水滴均為水性緩衝溶液並包含 PCR 過程所需的材料：DNA polymerase、primer、dNTPs，在適當的比例調配下，每個微小的水滴可少至僅含一條模板DNA 分子，使得每個水滴中的 PCR 反應互相不影響，只會忠實的放大同一條模板分子，所有的 PCR 產物平均地生合成且不會再因部分配對的雜合而被錯誤放大，PCR 反應材料不需競爭、也不因酵素催化的喜好性而出現偏向，徹底解決前述傳統 PCR 的問題 (圖一、右)。
在實驗過程中多多少少會遇到一些問題，例如有兩個分別貼上DNA及RNA標籤的樣品，在實驗過程中標籤都掉了此時該如何分辨？
也許分辨的方法不只一種，但其中一種是可以利用溶液PH值的酸鹼來辨別，首先將兩管樣品分別取出一些加入鹼性溶液中，再去跑膠則就可以判斷出哪一個為RNA。
RNA在鹼性環境下會有不穩定的現象，甚至會產生降解的情況，其原因是RNA 2號碳上的OH基會受到鹼性溶液(OH-)攻擊，而則造成phosphodiester bond 遭破壞而斷裂行成2’，3’-cyclic monophosphate derivative(如下圖)，所以在分子生物中PH值是很重要的介面之一。
為確保育種者的智慧財產權避免侵權事件、檢測作物是否為混合品種與協助追查農產品走私等皆需進行作物品種鑑定，因此良好的鑑定技術將有助於作物品種鑑定。
近年來國內已有多個單位透過簡單重複序列分子標誌多型性分析進行作物品種鑑定，以下針對簡單重複序列進行相關說明：
簡單重複序列 (simple sequence repeat) 簡稱SSR，又可稱為微衛星序列 (microsatellite)，是一種以2~6個核苷酸為一個 motif 的重複性序列，普遍存在於所有原核與真核生物基因體 (genome) 中。簡單重複序列於單一基因座 (single locus) 具有多重對偶基因 (multiple alleles) 與共顯性 (codominance) 遺傳的特性，此外簡單重複序列motif發生突變的機率相較於基因體的其他區域高，促使簡單重複序列於每個個體間存在著高度的變異性進而造就簡單重複序列成為鑑別度良好的分子標誌。
什麼是多樣性? 就從微生物當作例子說起吧!
人體的微生物對身體很重要，它們能保護人體健康，調節免疫系統，維護消化系統之運作。2013年興起了腸道環境與疾病相關議題，近期許多期刊上也相繼發表腸道環境(菌相)多樣性與疾病之相關性文獻。2013年6月份《自然Nature》期刊發表一篇文章，提及利用次世代定序儀器分別檢測代謝正常、不正常(血糖控制機能受損)與糖尿病之歐洲女性(平均年齡為70歲)之腸道環境(Gut metagenome)。結果發現，代謝不正常、糖尿病患者之腸道環境與代謝正常之腸道環境非常不同。那些代謝疾病之患者腸道環境改變，雖然腸道內之細菌數量一樣多但多樣性明顯較少。藉此推測，肥胖症、糖尿病與心血管疾病等相關代謝疾病與腸道環境之改變有關連。[1]
同樣地，2013年11月份，《科學Science》期刊發表兩篇[2、3]，關於癌症治療效果與腸道環境相關之文章。通常，罹患癌症之患者體力不佳且免疫系統較弱，因此容易受到外環境影響而感染，因此需要藉由抗生素來幫助癌症患者抵抗外環境之感染。但抗生素之使用會影響腸道內菌群發展，而菌群多樣性卻被證實影響著癌症患者接受化療的效果程度。《科學Science》期刊發表兩篇文獻內容皆以動物實驗為模組，結合次世代定序技術檢測腸道環境與癌症之腫瘤微環境的關係，並且指出腸道微生物能夠幫助癌症治療效果。不過，文獻中有提及，這些模組皆作用於動物體上，同時也期望未來在人體試驗上能夠看見署光。
不只腸道環境需要多樣性能夠維持人體健康，人體的免疫系統，同樣也需要多樣性，來維持與調節免疫系統。免疫系統是最了解自體的醫生，當免疫系統發生問題，那麼與免疫相關之疾病當然紛紛出現，因此，若能了解免疫醫生如何診斷與治療人體，那麼疾病也就更容易對付了。早在2009年PNAS[4]文獻發表，利用次世代定序儀器對免疫T細胞接受器( T Cell Receptor，TCR)的特地區域做定序，發現腸癌患者之免疫細胞多樣性比正常人少，免疫細胞的多樣性低及表示功能性較少，即便是免疫細胞總數不變，那麼面對疾病就相對變得難解了。
臺灣大學TechComm科技共同空間主辦[次世代高通量核酸定序工作坊] ，有勁將於當日分享光學圖譜(Optical Mapping)和基因體序列組裝(Genome de novo Assembly)的分析經驗。工作坊內容包含介紹Optical Mapping 的技術，不需要Cloning、PCR及Hybridization等技術，也不需要任何核酸序列的資料，就可提供高解析度的全基因體之限制酶酵素圖譜，進而瞭解完整的基因體架構。
現場還有專案研究諮商，歡迎有興趣的老師和同學撥空參加，演講相關訊息如下：
在先前的部落格中我們介紹過了在Windows 7平台下利用bowtie或bowtie2將NGS定序的資料和reference序列作alignment，並利用samtools進行檔案的處理以及利用IGV觀看瀏覽alignment結果
詳細內容可參照：
1. bowtie教學
自2005年Roche推出Roche/454 Genome Sequencer 20 System後，開啟了次世代定序的大門，經過不到10年的時間，第三世代的定序技術平台也問世了。本篇文章主要是介紹2010由Pacific Biosciences 公司發表的定序平台---PacBio RS，以及其定序原理---Single Molecule Real Time (SMRT) technology。
Figure 1. Zero-mode wave-guides (ZMWs) – small well-like containers & SMRT Cell & PacBio RS (擷取自http://smrt.me d.cornell.edu/FAQs.html)
癌症是個一直不斷在發展、演進、隨著環境改變的多樣化疾病。隨著對癌症的了解越多，癌症的異質性現象已經是許多關於轉移、抗藥性等的研究課題。1976年時Peter Nowell 曾發表他具有遠見的想法，癌症是變異細胞的演化過程，並且不斷的進行著環境篩選，造就了癌症細胞具有多樣的基因變化。也因此，個人化治療成了現在癌症治療的努力目標。關於癌症的異質性，如下圖一，除了類似癌症不同病人間會有異質性，同一個病人本身的癌組織也會有異質性。同一病人的癌組織的不同區域會有異質性，而原位癌組織與後續的附近區域、或是轉移、復發的癌組織也會彼此之間有異質性。
圖一 癌組織異質性之示意圖
當前的診斷與治療模式
近年來，生物技術發展多樣性，以及許多高分子材料（如：奈米粒子）的研究精進，其中更以『磁分離（Magnetic separation）』概念的純化機制，結合分生、物理與化學三者合一，具實驗獨特性。此技術涵蓋範圍廣泛，在核酸領域的應用方面，舉凡：poly-A mRNA的分離、DNA的純化與次代NGS定序，都有此技術參與其中，除此之外，也可應用於蛋白質純化，免疫學等用途。分生實驗過程的核酸分離和純化，會因目的性不同，而於帶磁性奈米粒子的表面，鑲嵌不一樣的配體（ligand），以利進行結合與親和的反應，常見例如：結合poly-A mRNA的oligo-(dT)、streptavidin等鑲嵌配體。這類型的實驗分離方式，泛稱為SPRI（Solid Phase Reversible Immobilisation）是一種固相-液相可逆化固定的分離純化技術，比起矽粒子（主要成分為SiO2）的分離更有效率，此項發明影響生命科學實驗的發展，有著舉足輕重的地位，亦逐漸成為現今NGS製備Library方面，於DNA的純化分離與分子量大小之篩選（size selection），不可或缺的一項工具，也是實驗步驟不可缺少的環節。
磁珠的發明構想與概念，最初由任教於挪威科技大學的化學家John Ugelstad 所研發製成，他在聚合物和膠體化學的領域貢獻甚多，也於1976年以聚苯乙烯（Polystyrene）為主要材質，製造出均勻磁化的球體粒子（稱為Dynabeads® ），這也是影響日後生物實驗材料革命性的重大突破。
在 RNA 樣品製備 NGS 定序上機的前端作業方面，Illumina 所採用的方式是使用 Oligo-dT 來篩選出帶有 PolyA tail 的 mRNA，然而這種方式面對品質較差的 RNA 時，將會受到限制，並且一些不帶有 PolyA tail 的 mRNA，將無法被觀察到，因此有其他廠商使用其它的策略發展新的製備方式，如：NuGEN Ovation，它可以使用少至 500 pg 的 RNA 來完成 library，並且即使 RNA 品質較差，依然可以適用。
圖一、 NuGEN 開發Ribo-SPIA 技術轉成雙股 cDNA
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