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DNA Genotek^® OrageneˑDNA ( OG-500 )DNA Collection Kit在臨床上的應用

在實驗室大家應該都有使用過DNA萃取套組 ( DNA isolation ) 的經驗，大部分的DNA萃取套組都需要一定的樣品量或檢體才可以萃取到足夠量的DNA，並且會因樣品取得的難易度及樣品保存的效果而影響後續實驗的結果好壞，倘若萃取出來的DNA品質還要符合生物晶片 ( Microarray ) 或次世代定序 ( Next generation sequencing , NGS )等實驗的樣品要求則難度相對提高許多。

    目前 DNA Genotek^® 公司推出一款 OrageneˑDNA (OG-500) 樣品保存套組 (DNA Collection Kit )，可藉由此套組將臨床上病人少量的唾液樣品快速保存起來，經測試此套組所保存的樣品在 24°C 及 37°C 測試條件保存五年，發現所萃取的 DNA 片段長度仍可維持在 23Kb 以上，而在 50°C 保存條件下樣品 DNA 至少可以維持 187 天 ( 如表1 )。

目前 De Novo 序列組裝演算法有兩種, 一種稱為 overlap-layout-consensus , 簡稱 OLC. 另一種則是 de-bruijn-graph , 簡稱 DBG.

OLC 方法較為直觀, 先是將所有的 reads 做兩兩比對( pair-wise alignment ), 找出 reads 重疊( overlap )的區域, 再以圖學( graph theory )的方式呈現( layout ) reads 之間的重疊的關係, 以節點( vertex )表示 read, 邊( edge )表示 read 之間的重疊, 見圖一.

最後, 我們要將圖轉為序列. 這個問題, 和一個古典的問題相同, 就是漢米爾頓路徑問題 ( Hamiltonian Path Problem ), 如何走過圖上每一個節點, 而且每一個節點只經過一次？

目前組裝以OLC演算法為基礎的軟體有 Arachne, CAP3, Phrap, Newbler 等.

近幾年來，由於科學家發現 miRNA 與調節基因的表現量有相關，甚至與疾病也有一定的關係存在，所以生物學家慢慢將研究重心趨向 miRNA。Figure1 是從 2001 年到 2010 年與 miRNA 相關研究的資料，由下圖可以看出近年來研究 miRNA 是越來越多了

因為 miRNA 的表現量與疾病有關，所以可以藉由 miRNA 定量來找出疾病的作用機轉作為新藥物開發之標的。miRNA 定量是藉由 real-time reverse transcription PCR、microarray 與 NGS，而後者 NGS 與前兩者最大不同是在於 NGS 不僅可以找到已知 miRNA 還可以找到未知的 miRNA，則更有利藥物開發，以下 table1 為目前針對 miRNA 所以開發藥物的例子。

RNA-Seq 雖然是這幾年發展的技術，但已經成為分析 transcriptome 的方法，可用來組裝 transcript ，發現 splicing variants 、 single-nucleotide variations 及 fusion genes 等，而 strand specific RNA 更可協助 transcript 組裝及 genome annotation 的正確性。 Lin Wang 等人在 2011 年發表在 PLoS ONE 期刊所發表的研究，提到如何做 strand specific RNA 的 Library construction、與 non-strand specific RNA protocol 比較，及協助證實 gene model 正確性，以下就做個介紹：

Library construction of Strand-Specific RNA-seq
Lin Wang 等人發展的 strand specific RNA-seq 的 Library construction 的方法（如下圖），與 Illumina 原廠所使用的方法差異性不大，只是在第二股 cDNA 合成時，使用 dUTP 取代 dTTP ，並在 Y-shaped Adapter 接上後，利用 uracil-DNA glycosylase （UDG）切除含 dUTP-marked strand。

在次世代定序 RNA-seq 成為 transcriptome 研究的主要來源前，我們多是使用 microarray 來分析基因體表現量的變化與樣本條件之間的關聯性，例如：基因表現量與不同組織細胞的性狀。每一個個體的 transcriptome 受到基因體變異而不一樣，像是 SNP、copy number 的變異。而直接分析轉錄本的表現量變化是最容易觀察到與性狀之間的關係。一般定義真核細胞中的一個基因被轉錄後，其調控會透過 RNA edit (例如 splicing ) 形成多種轉錄本。不同轉錄本的表現量變化造成性狀不同的關聯性可能更高。RNA-seq 高解析度的定量 mRNA，提供給研究人員們一個機會來研究轉錄本的變化。

於是有西班牙生物資訊學家開始研究如何用 RNA-seq 來分析 reference genome 上的同一個基因內不同轉錄本表現量的差異。轉錄體的比較比基因表現量的比較要來的複雜。計算上，我們會假設不同的基因之間表現量的資訊是獨立變數，但是相同基因內的轉錄本數量，卻有相依性。某一轉錄本的數量越多會造成其他轉錄本的表現量減少。因此需要思考各個轉錄本 RPKM 在個體間的差異要如何分析。

如圖所示，我們利用 microarray 或是 RNA-seq 所偵測到的基因表現量與轉錄本之間的表現量可能存在著以下四類關係(在極端的情況下)： a) 基因及其轉錄本的比例變化皆不大、 b) 基因表現量在個體間差異大，但是轉錄本的表現量比例一致較無變化、 c) 基因表現量穩定，但是所屬的轉錄本表現量比例變化大、 d) 表現量及轉錄本的表現量變化皆很大。有此可見，如果只看基因表現量的變化，其代表性及關連性可能不足以讓我們發現和性狀之間的關係，因此忽略了這些變化比例不定的轉錄本所隱含的功能。

傳統中藥醫學(Traditional Chinese Medicines ,TCMs)，於博大精深的中國已超過3000年載的使用歷史，隨著日新月異的醫學科技，訴求自然之傳統中醫業已與速效的西醫並駕齊驅，很多醫學觀念亦紛紛導向中西合璧之途，在各種醫學評估及試圖尋找西藥替代品的情況下，中草藥勢必為首選。而中藥產品的日益普及，與其接受度漸趨增加，也使得產值逐年水漲船高，消費者除了注意藥品安全問題外，亦衍生出藥物來源合法性之問題，但往往在選購中藥產品時，看見的只是包裝的成分內容，附註之藥品標籤是否誠實，亦或其中隱藏很多摻假不實的添加成分，皆無從得知，而消費者就可能成為這場交易中的蒙蔽者。甚至有不肖商人，利用違法的瀕臨絕種動植物為藥材，或添加禁止入藥之植物萃取物試圖魚目混珠，這些非法行為都可能導致消費者身體損害或後遺症。迄今，鑑識中藥內容方式，雖可鑑別出植物成分，但也侷限於已知標準品的範圍，欲知其確切來自何物種仍有難度，因此，要如何有效把關這些市面上流通的中藥產品，本篇作者將中藥檢驗結合次代定序 (NGS) 平臺，探究每種藥品中所含之 DNA 種類，將其序列與已知動植物之 DNA 資料庫進行比對，利用此方式作者成功鑑定出中藥成分的物種來源。此外，為了達到保護野生動植物的永續發展，也結合瀕臨絕種野生動植物國際貿易公約，探討這些中藥來源的合法性，作者分析由澳洲海關人員所查扣包含粉末、錠劑、膠囊與草藥等多種違反當地環境法之中藥製品 (圖一)

科學家們發現在不同環境發現的古生物化石 DNA，其受損降解的情形其實是很類似的，使用次代定序的平臺研究古代 DNA 能夠直接的檢測許多現象，為人熟知的例如：嘌呤丟失作用 (Depurination)、胞嘧啶的去胺基作用(Cytosine deamiation)、fragmentation rate……等等。

   下圖一是研究人員將始祖馬的次代定序所獲得的讀序，比對回現代馬基因體後所做的統計分析結果，觀察發現古生物 DNA 時常斷裂在嘌呤 (Guanine、Adenosine) 的後方 (Y 軸標示 -1 位置)，也因此讀序的第一個鹼基 (Y 軸標示 +1 位置) 有較高的機率出現嘧啶 (Cytosine、Thymine )，這一項證據似乎可以證明嘌呤丟失作用 (Depurination) 對於 DNA 斷裂降解的影響。

圖一

NGS 的高輸出量特性，帶給基因體學研究上的突破，然而，目前技術仍有存在一些缺陷，其中最令人詬病的點是定序深度不均勻，造成 NGS 必須提升定序深度，來彌補定序深度不均勻的問題。造成定序深度不均勻的原因很多，其中最明顯的就是序列 AT 或 GC bias 造成，往往 high AT 或 high GC 的區域很難得到滿意的定序品質與定序深度；有一部分的原因很可能是 library 製備過程中造成的，一般 NGS DNA library 製備流程包含，fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation、PCR 等步驟，製備流程中，所有的環節都有可能會造成bias，當然包含每一個純化的步驟。為了釐清到底是哪一步驟造成，Aird 團隊利用 QPCR 來檢驗 library 製備流程產生 bias 的情況 (Aird et al. , 2011)，結果整理於圖一，縱軸是序列的數量，橫軸是 GC content 的百分比。由圖一可以清楚地觀察到，library 製備的流程中，PCR 過程是造成 bias 的主要原因 (圖一)；而 fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation 等步驟，不太會產生 high AT 或 high GC 的區域定序深度下降的問題。

圖一

要讓定序深度更加平均，從 PCR 步驟進行改良將是最有效率的。當然製作 PCR free 的 library 一定是最有用的方式，除此之外，還有三種方式來改善 PCR 造成的問題:

當我們進行 miRNA 定序時，有時我們會發現有一些 reads 沒有辦法 map 到 miRBase 中的miRNA 序列，那這些 reads 究竟是什麼呢？

由於在樣本備製時，是以 size selection 來決定要定序的 RNA ，只要 RNA 的size 是落在我們所設定範圍內，都會被定序到，所以這些無法對到miRBase 的RNA ，有可能是其他的 small RNA ，也有可能是 degrade 的 RNA，當然也有可能是 Novel miRNA。

我們該如何判斷得到的 reads 是屬於 Novel miRNA，並知道此 Novel miRNA 的 hairpin 的位置與序列呢？

首先，我們要先有我們所研究之物種的 genome sequence。

當我們想要研究一個物種，可是卻發現這個物種的序列資料 (DNA or RNA) 並不存在於世界上現有的資料庫。當我們遇到這種情況，便可以利用 NGS 的資料來進行所謂的 de novo assembly，藉此幫助我們獲取此物種的序列內容。而一個常見的 de novo assembly 流程概念如下：

 
上圖表示將 NGS 的定序資料隨機抽取出兩條 reads (紅色線條)，觀察此 reads 的尾端序列是否相同。如有某區域相同(藍色序列)，則將此區域的序列合併連結起來，最後獲得一條更長的序列。透過這樣不斷的重複尋找，最終我們便可以將 reads 的資料還原回 genome 序列。

上述的過程是一個理想狀態，然而事實上有許多因素會造成我們組裝困難，我們將這些因素條列如後：

之前我們在”跨越定序平台的迷思”一文中提到，同一個library在Illumina的兩個不同定序機台 (Miseq 及 Hiseq2000) 定序的結果並沒有特別的差異。然而，同一樣品在不同 library 製備方法下，會產生出不同的定序結果嗎?

        2012 年 Joern Toedling 的研究團隊以 small RNA sequencing 做了一系列相關的研究，其將老鼠的 ES_XX (embryonic stem cell line female) 及 ES_XY (embryonic stem cell line male) 做為比較的對象，以不同平台的 small RNA library 的製備法處理樣品，並且分析其定序資料，不同製備法配合樣品的資訊如下表。

  作者以 pair-wise Spearman rank correlation 分析上表十個樣品間 miRNA reads 數量的 correlation，並且將結果以 heatmap 形式呈現(如下圖)