有勁的基因資訊

基因的轉錄後調控常常發生在mRNA的3’UTR，近兩年許多團隊透過NGS技術來研究3’UTR的調控及演化，並發現了新的調控機制。以線蟲為例，由於線蟲大部分基因的3’UTR缺少註解，Calvin H.Jan 等人在2010年透過3P-Seq的方法將RNA尾巴位置透過NGS技術定序後，經分析發現高比例的A/U序列內容會促進線蟲基因體的壓縮 ( genome compaction )，因為造成切割的因子是A/U高比例的，也因此他們容易在A/U高比例的序列內容中出現。事實上30%的protein-coding基因有不同的mRNA型態 ( alternative mRNA isoform )，另外在尾巴距離很近但不同的切割位置以往都是被忽略掉的，作者發現大量的這種isoform可能是線蟲3’UTR在演化上逐漸變短的中間物。甚至作者發現三分之一的匯聚基因對( convergent gene pair) 在3’UTR重疊的地方，將具有正負股雙面功能的因子在序列上做回文的排列，這個現象節省了基因之間的距離，造成基因體的壓縮。雖然線蟲3’UTR的長度只有哺乳動物的六分之一，但線蟲具有保留性miRNA位置的密度是哺乳動物的兩倍。部分是因為有更多類型的種子互補位置 ( seed complementary site ) 較傾向被保留。這些發現揭開了切割與多聚腺苷酸化對基因結構演化的影響，也提供了研究後轉錄基因調控的資源。

透過3P-Seq方法確保oligo(dT)是和3’UTR的polyA接合，而不是internal polyA的序列接合。

FPKM 是 Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads 的縮寫，FPKM 與 RPKM 其實是幾乎一樣的東西，都是用來衡量 transcripts (mRNA) 表現量的一種指標，兩者主要的不同在於計算單位上的不同，RPKM 是以 Reads 為單位，而 FPKM 是以 paired-end reads 為單位，一對 paired-end reads 視為一個 Fragment，所以 FPKM 僅適用於 paired-end 的定序資料。
在 RPKM 中，只要 read 能 map 到 transcripts，即列入計算，在 FPKM 中，只有 paired-end reads 都能 map 到 transcript (在符合 quality 條件下)，才列入計算，若 paired-end reads 中只有一個 read 能 map 到 transcript，或是其中有某個 read 的 quality 太差，都不會列入計算。

FPKM 目前主要常見於 Cufflinks 這個 RNA-Seq 分析軟體的分析結果上。

一直以來，癌症研究中一直缺乏能夠在早期判斷罹癌的指標，如今相關研究有了一項新的進步。臨床醫學的癌症病人檢體中，有一個特別的現象，在病人癌組織以及正常組織中的 miRNA 組成種類會產生變化，但是由於癌組織採取十分不方便，因此可能癌症已進入末期才被發現。如今科學家們，在病人血液、尿液、唾液等檢體中發現也能觀察到這個現象，miRNA 隨著體內循環系統循環而容易被醫檢系統取得，如此也許能替癌症預防多了一股新的曙光！

許多的癌症在初期並不明顯，不易被偵測檢驗，而癌細胞隨著人體內循環系統：血液、淋巴腺等轉移，很多病例在發現出現症狀時，往往都是轉移後癌末惡性腫瘤。2011 年 1 月發表在 Journal of Biomedicine and Biotechnology 期刊上有一則相關的研究被報導，QianWu 等人研究乳癌病人的罹癌組織與健康組織 miRNA 之區別時，使用次世代的定序系統列出所有在罹癌組織被大量形成的 miRNA 種類 (下圖)，超過 2 倍以上則視為有差異。再更進一步的嚴格限制，以超過五倍以上的 miRNA 當作模板，設計出 qPCR 需要的引子對，用來偵測其他乳癌病人的血漿。結果發現，編號 miR-29a 以及 miR21 在血漿中也能大量的被偵測到！

癌症的發生主要是細胞基因發生變異，常見的是在染色體內或染色體間發生相互重組的現象，而導致染色體結構的不穩定。根據研究指出¹ (圖一)，即使是同一種癌症，在不同病患內的癌細胞顯現出的基因變異模式皆不相同。因此，為了防止病患接受不適當的抗癌藥物治療，導致化療後不但沒有成效，更受到副作用的侵害，癌症的治療需分析每個病患基因變異的模式，針對每個病患特有的變異做最精確的抗癌藥物篩選，除此之外，找出的變異區也可做為後續診斷的依據。

圖一

CSPro 是 Certified Service Provider 的縮寫，Illumina CSPro 指的是 Illumina 服務提供者認證計畫，其目的是保證服務提供者 (供應商) 能使用 Illumina 最先進的科技提供最高品質基因分析服務。得到 Illumina 服務認證的服務提供者必需通過幾個步驟:

需要 Illumina 原廠的 FAS 進行筆試，並審查所產生的資料量是否符合原廠所規範資料量。

然後在原廠的 FAS 現場見證下，使用原廠提供的試劑、kit 進行測試，通過品質管制 (QC) 測試後，進行實驗管控流程以及最佳操作步驟的認定，其認定項目包含資料分析、化學藥劑的保存、樣本的配製與保存與建檔，確認一切均符合 Illumina 的建議與規範。

PCR-Free 顧名思義是指不經 PCR 步驟而完成 library construction。

一般來說 library construction 都須經由 PCR 放大再做定序，放大後的 library 會產生幾種情況：

microRNA(miRNA)是一段長度約22個核苷酸的RNA分子，由DNA轉錄而來但並不會表現成蛋白質。主要的功能為調控動物和植物的轉譯後修飾，很多癌症被發現可能由這些小RNA分子所影響。當miRNA與其被調控基因的binding target site 鍵結後，會抑制其基因的表現(抑制轉譯)或使其基因轉錄後的RNA序列斷裂。miRNA與基因binding target site通常是落在transcript的3’UTR，以miRNA 5’方向的第2到第8核苷酸(seed區域)與transcript完美鍵結，此外研究發現miRNA的seed區域與基因binding時，可以是G:U wobble的模式鍵結，或是在seed的區域有少數的核苷酸並沒鍵結(Imperfect seed)；miRNA與基因的binding site也可能落在3’UTR以外的區域。

利用NGS的技術來定序miRNA(small RNA)後，可快速大量尋找以前未知的novel miRNA，從NGS的資料我們可以利用一些找尋novel miRNA的預測軟體例如:miRDeep and Mireap，這些軟體可以讓我們得到未知和已知miRNA和其表現量，使我們能夠更清楚了解某細胞或某組織下miRNA表現的多寡，可以減少做生物實驗的時間。了解可能會影響miRNA，其預測miRNA與其被調控的基因位置是一件很重要的事情，較早的預測軟體TargetScan、PicTar可預測target binding site於3’UTR 且seed區域完美鍵結的基因有哪些。隨後發展的miRanda可預測seed區域為G:U wobble的樣式及seed區域並非完美鍵結的情況。而PITA及rna22則可預測target binding site不是在3’UTR的情形。

使用 NGS 系統應用在物種全基因體上定序上是已發展成熟的技術，然而在真核生物的研究方面，有著高等生物基因體過於龐大複雜的難題存在，在過去，科學家們想研究物種的基因體特定區域時，往往只能小部份的使用 PCR 增幅目標區域並定序之，如今結合上 Exome Capture 技術以及 NGS 系統，能夠讓科學家們專注在研究目標的表現基因上，還能以更便宜的價格，獲得較全基因體定序深度更深的序列資料。

以人類基因體舉例來說，30 億個鹼基對的全基因體序列，Exome 部份僅有其中的 3000 萬，這表示許多科學家們著手研究一項研究主題時，可能僅是對其中 1% 的序列感興趣，因此出現了利用 DNA 雜合原理為基礎的 Exome Capture 技術。下圖為 Exome Capture 的流程圖，我們將製備完成的 DNA library，在鹼的環境下打斷氫鍵變成單股，在加入掛上 Biotin 的單股 DNA Exome probe，使得基因體中的 Exome 部份被這些 probe 雜合上，其後再使用帶有磁珠的 Streptavidin，留下 Exome 洗去不需要的基因部分。除此之外尚有其他三種 Exome Capture 的方式，有的需要 DNA polymerase 參予，不過原理仍大同小異，最重要的部分，仍然是 Exome Probe 的設計，要利用小片段的 DNA (ex: 95 mer) 專一性的抓住較大片段的 DNA (ex: 350 mer)，是需要經過精密的設計以及評估的。 

N50是一個用來評估de novo assembly效果好壞的方法之一。當我們把contig或scaffold從大到小排列後，從最大的contig開始進行長度的累加，當累加長度達到全部contig或scaffold總長度的50%時，這時所加上的contig或scaffold長度，即為N50。如下圖所示：

而N50的50，即為50%的意思。同理，N25即代表25%；N75即代表75%。數字越大，則評估條件越嚴苛。

ChIP-sequencing是研究蛋白質與DNA互動的一種方法，是利用抗體與抗原結合的特性，將蛋白質與互動的DNA抓下，再透過DNA純化的方法，取得與蛋白質互動的DNA，然後透過次世代定序的技術來得到該DNA正確的序列。

其實驗流程為: 進行免疫沉澱，加入對目標蛋白質具高專一性與靈敏性的抗體，抓下蛋白質與其所附著的DNA，透過DNA純化去除蛋白質得到DNA，然後進行定序。

NGS具有高輸出量的特性，而且不需經過bacterial cloning的過程，這兩種特性使得定序的成本大大得降低，至2010年底，以Illumina系統為例，定序成本，每1bp約只需要花費新台幣0.0002元，遠低於Sanger sequencing成本0.2元/bp。NGS所具有的高輸出量與高解析度特性，使其應用範圍也日趨廣泛，遍及基因體學、生物醫學、環境科學等研究 (上圖)；而利用NGS 系統的研究論文也越來越多 (下圖 橘色線)，數量呈現對數成長，反觀Microarray與QPCR，研究論文的數量已經趨近於飽和 (下圖 藍線與紫線)，而利用Southern與Northern bolt的研究論文數量有下降的趨勢 (下圖 淡紫色線)，這說明著NGS的時代已經到來，NGS技術已成熟且普及化，解決了從前的技術無法解決的難題。