有勁的基因資訊

自人類有歷史以來，就有犯罪的發生，其原因各殊且程度也有差別。如何防杜這些層出不窮的案件，並從中釐清案情的來龍去脈，這些課題就顯得格外重要，隨著生物科技時代更替，許多破案關鍵也都仰賴於此，將生物科技引入犯罪的相關調查與研究，更成為炙手可熱的話題，不僅讓棘手案件抽絲剝繭，更試圖從中尋找蛛絲馬跡，利用微物跡證讓開棺驗屍不再沉默不語。

當前激烈的市場競爭態勢下，每凡新商品的推出，總需要廣告行銷，提升產品知名度，若經由名人試用或代言後，或多或少有黃袍加身效果，以及吸引許多鎂光燈的焦點，在體壇上幾位知名的運動產品代言人，例如：籃球大帝詹姆士（LeBron James）、足球天才梅西（Messi）以及網壇世界球王喬科維奇（Djokovic）等…，都是替廠商帶來龐大的商機。

NGS基因定序的市場亦是如此，英特爾公司（Intel）創辦人之一，同時也是 IC（積體電路）領域中，提出摩爾定律（ Moore’s Law）的高登‧摩爾（Gordon Moore），是第一個利用非光學概念（Post-light sequencing）進行定序的企業名人；然而，已故的蘋果電腦創辦人―賈伯斯（Steve Jobs），其實罹患胰臟癌時，也曾花費10萬美金尋求先進的基因醫療，由當時 Foundation Medicine研究團隊（研究人員由MIT麻省理工學院和哈佛博德研究所組成），進行相關定序實驗檢測，目的是找出癌細胞與基因之間的癥結點，了解基因有哪些缺陷導致癌症？最終，賈伯斯儘管不敵癌症的侵襲，但卻留下了那麼一句話：「我若非是基因定序而成功抗癌的第一人，就是最後因癌症辭世的人。（I’m either going to be one of the first to be able to outrun a cancer like this, or I’m going to be one of the last to die from it.）」。由此可見，賈伯斯對於基因定序的醫學價值，仍堅信是未來的抗癌療法，這些企業名人的親身經驗，都為NGS基因定序創造更多生技醫學的話題。

現今電腦科技的突飛猛進，早已跳脫摩根定律。2001年大導演史蒂芬史匹柏所執導的電影「AI人工智慧」，乃至於2004年威爾史密斯所主演的「機械公敵」，都是以智慧型機器取代工業與生活所需，工作面貌則呈現來勢洶洶的機器大軍。從法國工業革命到現代的產業革命，從半自動的設備躍升為智慧型的自動化儀器，機器始終扮演重要的角色。次世代定序科技（Next Generation Sequencing，NGS）的實驗操作，在智慧型機器化的氛圍薰陶下，也催生了全自動化實驗操作設備，本公司因應時代創新潮流，更是引進這套全自動的實驗系統『Ion Chef ™ System』，這台儀器好比一台五星級的主廚快餐車，定序DNA樣品都可經由 Ion Chef ™ 自動化的流程，進而完成定序前的處理作業，讓定序實驗的安排流程更有效率，品質更為一致性，亦省去人為實驗的時間束縛。機器人時代來臨，就投資角度而言，取代傳統人力，的確有助於企業長期獲利及產品穩定品管，這是未來勢在必行的方向，或許會發生不可預知影響，也可能會產生大量的取代事件，未來改變只會更快速，或許顛覆現在所想像，僅管如此，我們依然要充分準備好迎接智慧機器次時代的來臨。  

為確保育種者的智慧財產權避免侵權事件、檢測作物是否為混合品種與協助追查農產品走私等皆需進行作物品種鑑定，因此良好的鑑定技術將有助於作物品種鑑定。

近年來國內已有多個單位透過簡單重複序列分子標誌多型性分析進行作物品種鑑定，以下針對簡單重複序列進行相關說明：

簡單重複序列 (simple sequence repeat) 簡稱SSR，又可稱為微衛星序列 (microsatellite)，是一種以2~6個核苷酸為一個 motif 的重複性序列，普遍存在於所有原核與真核生物基因體 (genome) 中。簡單重複序列於單一基因座 (single locus) 具有多重對偶基因 (multiple alleles) 與共顯性 (codominance) 遺傳的特性，此外簡單重複序列motif發生突變的機率相較於基因體的其他區域高，促使簡單重複序列於每個個體間存在著高度的變異性進而造就簡單重複序列成為鑑別度良好的分子標誌。

自2005年Roche推出Roche/454 Genome Sequencer 20 System後，開啟了次世代定序的大門，經過不到10年的時間，第三世代的定序技術平台也問世了。本篇文章主要是介紹2010由Pacific Biosciences 公司發表的定序平台---PacBio RS，以及其定序原理---Single Molecule Real Time (SMRT) technology。

Figure 1. Zero-mode wave-guides (ZMWs) – small well-like containers & SMRT Cell & PacBio RS (擷取自http://smrt.me d.cornell.edu/FAQs.html)

近年來，生物技術發展多樣性，以及許多高分子材料（如：奈米粒子）的研究精進，其中更以『磁分離（Magnetic separation）』概念的純化機制，結合分生、物理與化學三者合一，具實驗獨特性。此技術涵蓋範圍廣泛，在核酸領域的應用方面，舉凡：poly-A mRNA的分離、DNA的純化與次代NGS定序，都有此技術參與其中，除此之外，也可應用於蛋白質純化，免疫學等用途。分生實驗過程的核酸分離和純化，會因目的性不同，而於帶磁性奈米粒子的表面，鑲嵌不一樣的配體（ligand），以利進行結合與親和的反應，常見例如：結合poly-A mRNA的oligo-(dT)、streptavidin等鑲嵌配體。這類型的實驗分離方式，泛稱為SPRI（Solid Phase Reversible Immobilisation）是一種固相-液相可逆化固定的分離純化技術，比起矽粒子（主要成分為SiO₂）的分離更有效率，此項發明影響生命科學實驗的發展，有著舉足輕重的地位，亦逐漸成為現今NGS製備Library方面，於DNA的純化分離與分子量大小之篩選（size selection），不可或缺的一項工具，也是實驗步驟不可缺少的環節。

磁珠的發明構想與概念，最初由任教於挪威科技大學的化學家John Ugelstad 所研發製成，他在聚合物和膠體化學的領域貢獻甚多，也於1976年以聚苯乙烯（Polystyrene）為主要材質，製造出均勻磁化的球體粒子（稱為Dynabeads^® ），這也是影響日後生物實驗材料革命性的重大突破。

A型流感病毒是人類最常感染的流行病毒 。以2009年發生大流行的H1N1為例，H1N1屬於A 型流感病毒，其病毒的基因是由人、鳥禽和豬的基因所組成。患有H1N1 的患者可能會有發燒、頭痛、全身性肌肉痠痛、咳嗽、喉嚨痛和鼻塞的症狀。而這種高度傳染的病毒有曾被世界衛生組織發出等級6的流行病警告。

由於病毒的高度抗原漂變(Antigenic drift )的能力，讓流感疫苗的效果有限。除此之外，病患若是同時感染兩種病毒，而使的不同病毒之間發生基因的片段重組(antigenic shift)，使的在2009年發現了新型的病毒變種，而造成流感大流行。

Oseltamivir (奧司他偉，俗稱克流感)是其中一種針對H1N1的神經氨酸酶(Neurminidase, 簡稱NA，主要功能是幫助新生成的病毒脫離被感染的宿主細胞)有效抑制活性的藥物。而A 型流感病毒具有Antigenic drift和antigenic shift的特性，在神經氨酸酶基因發生突變，所以在2007-2008年，雖然只發現少數的對克流感有抗藥性的 H1N1 病例，但而後發現之後的H1N1亞型流感有99.4% 幾乎都有抗藥性。

SSR(simple sequence repeat)是指兩個或多個核甘酸重複排列，重複的核甘酸稱為一個motif，重複的次數在不同的個體或族群中會有所不同，為一種多型性(polymorphism)的類型；以Jun在大豆芽的研究為例，如下圖一，研究團隊收集了不同區域的大豆芽(soybean aphid)，分別在美國的俄亥俄州(OH)、伊利諾州(IL)、明尼蘇達州(MN)及加拿大的安大略省(ON)，可發現不同區域的大豆芽，motif重複的次數會有所相異。

在Jun的研究中，為第一個針對大豆芽的genomic DNA使用NGS定序後，經過de novo assembly後的contigs從中找尋SSR marker及比較在不同區域中的genetic diversity。同樣的分析概念也可應用於RNA-Seq，在Parchman的研究中，定序了黑松(P. contorta)的RNA，透過de novo assembly及reference-guided assembly後的contigs，來找尋SSR marker，圖二為Parchman研究中的流程，可供想做相關研究的團隊一個參考。

    不久前炒得沸沸揚揚的社會新聞，「麥當勞驅趕唐氏症者」這個斗大的新聞標題，不僅震懾社會大眾，而且引發國內民眾高度的關注，由此事件讓大家重新審視唐氏症於社會上的待遇與生活情況。唐氏症（Down syndrome）這個名詞其實大家應該不陌生，最初由John Langdon Down 醫生，於1866 年首次發表此相關外表徵狀；接著在1959 年，由Jerome Lejeune 等遺傳學者發現該症狀是由於染色體缺陷所造成。所謂的唐氏症，簡言之，就是精或卵於減數分裂時所產生的非單套異常，使原本兩兩配對的23 對染色體(包含性染色體XX 與XY)，其中第21 對染色體有三條染色體的不成雙配對現象（即trisomy 21），造成細胞有46+1 條之染色體異常病變，這種患者會伴隨智能障礙等現象，唐寶寶的照料其實會對家屬造成終其一生的心理與經濟之負擔。因此，如何在懷孕初期預防此種染色體異常的胎兒出生，無論是對家庭或是社會，無一是正面的消息。

    其實生殖醫學的進步皆有脈絡可循，追溯歷史沿革的演進過程，自1947 年首次在血液中發現游離核酸（Cell-free DNA，cfDNA）之存在以來，直至1997 年，此項發現才開始漸趨應用在醫學方面，並且首次研究懷孕母親血漿內含有胎兒之游離核酸（cell-free fetal DNA，cffDNA），這項劃時代的發現，在胎兒醫學上儼然成為矚目的未來之星。近幾年，隨著次代定序（Next generation sequencing，NGS）的技術發展不斷突飛猛進，更加速cffDNA 的研究進展與醫學應用性。直接影響所及，即為可利用無創性且低風險的方式（如：抽血等）獲取懷孕母親的cffDNA，進而利用NGS 定序搭配生物資訊的分析，初步比對胎兒在第21 對染色體上，其是否有造成唐氏症之不成對疑慮(圖一)，藉此也可大幅降低羊膜穿刺的醫療行為所造成較高風險之產檢。除此之外，Swanson 等學者整理不同實驗室之研究數據，這些報導皆針對35 至40 歲高齡產婦的對象，於其懷孕3 至4 個月期間抽取cffDNA，利用NGS 技術進行定序，進行關於染色體所造成遺傳疾病之相關研究，比較四個不同研究團隊的實驗結果均顯示，對偵測染色體數目異常之敏感度（sensitivity）與專一性（specificity）皆有相似之處，意味著利用 NGS 進行非侵入性的產前檢查，也具有相當程度的可靠性。利用此項NGS 技術，除可觀察到 trisomy 21 導致的唐氏症外，其他在醫學同屬常見之遺傳症狀—染色體不成對（Aneuploidy），如：trisomy 18 導致艾德華氏症（Edwards syndrome）、trisomy 13 導致巴陶氏症（Patau syndrome）及透納氏症（monosomy X）等，也可透過次代定序的技術，檢測出這些可能造成胎兒不正常的遺傳疾病(表一)，這項新一代之定序技術發展及推廣，不僅將會是未來產檢的趨勢，且於國內外皆已廣泛宣傳推行，並逐步被民眾接受與採納。

腦脊髓液是直接與人類大腦或神經接觸的體液，所以在研究或臨床診斷神經性病變、中樞神經腫瘤、腦部創傷及腦膜炎等疾病時，皆會進一步探究腦脊髓液的內容物，若其中存有大量特殊蛋白、細菌、異常顏色或細胞，可協助醫師執行後續治療策略，在研究上，亦能輔助判斷疾病的致病機制。

目前已有許多研究利用次世代定序分析血漿內游離的miRNA，其具有潛力做為許多疾病的marker，本部落格在先前文章已有介紹。針對腦脊髓液內游離的miRNA，多數研究是利用qRT-PCR研究，例如在阿茲海默症有被發現miRNA表現情形與正常人不同，但較少利用次世代定序研究腦脊髓液的miRNA，此主因為每個病人一次取得的腦脊髓液有限，這些腦脊髓液含有的total RNA總量極為稀少，而miRNA又以極低量存在這些微量total RNA中，所以導致實驗執行上的困難。

Kasandra Lovette Burgos等科學家為突破此困難，首先，他們先找尋最適合萃取腦脊髓液游離RNA的試劑，其應符合高回收率、無RNA長度的限制及操作方便性，作者先以性質類似的血漿做為測試的樣品，比較各式萃取試劑的回收率，結果如下圖，在200 ul的腦脊髓液內，回收率較佳的試劑組為mirVana、PARIS mirVana、Qiagen miRNeasy及BiooPure，約能萃取到15 ng的total RNA。

NGS不僅可以協助物種解序更可以幫助癌症研究與臨床應用，就如下圖所顯示的有RNA-seq與ChIP- seq …..等等，提供更多訊息來瞭解cancer genome與設計出個人化的治療。

在癌症研究方面，在過去幾年中，NGS對於癌症研究不只扮演提供新的遺傳變異的角色，更得到癌症生成與轉移的複雜性之瞭解。使用NGS做研究的癌症種類有乳癌與直腸癌 .....等等。如下表

RNA病毒是許多重要疾病的致病源，包含AIDS、流感、SARS等造成大眾健康威脅的疾病。常用標準的檢驗方式，仍需要依靠已知的核酸序列或者蛋白質抗原資訊來完成檢驗確認；近年來次世代定序技術發展快速，可應用於新興未知的病毒鑑定，然而真正應用於臨床上仍有其困難點，由臨床樣品抽取得到的核酸量通常很低且品質很差，並且包含大量非感染源的核酸，會造成分析上的困難，無法正確de novo出真正病原的genome。

本篇研究[1]以愛滋病毒(HIV)、西尼羅病毒(West Nile virus)以及呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus)作為樣品測試，在實驗部分使用SPIA(single-primer isothermal linear amplification)的技術放大核酸，在生物資訊分析的部分使用VICUNA組裝程式，將上述三組病毒，原始核酸總量介於femtograms到attograms之間，成功組裝出其完整的”基因序列”；此研究開啟了NGS實際應用於臨床檢驗的大門，對於未來可能發生的新興病毒檢測，有極大的助益。

SPIA技術由Nurith Kurn等人於2005年[2]所發展，此技術價值在於可以保留真實核酸組成的profile前提下，放大核酸總量達萬倍以上(picogram total RNA to several microgram cDNA，Ovation®

 RNA-Seq System V2)。原理如下圖：

Next Generation Sequencing 這個名稱是相較於傳統定序技術而言。

傳統的定序技術包括:

• Chemical Sequencing

• Sanger Sequencing

一般見到「傳統定序技術」大部份是指 Sanger 的定序方法。

心肌病(CVD)是指伴有心肌功能障礙的心肌疾病。這類心血管疾病各個國家中一直是罹病死亡的主要因素，在2005年在全世界約有30%的死亡人數(約1700百萬)離病死亡。新聞常常看到有青壯年發生心臟性猝死。這些情況常常是突發的心悸、暈倒之後休克，較嚴重的可能會無預警的猝死；但是病患在平常是很難被診斷出來的。單光在歐洲，就有48%的人死於心血管疾病，也造成23%的醫療負擔。儘管現代醫療管理方面進步，像是CVD的預後、致病機制研究和尋找潛在治療方法仍非常重要。

CVD常常伴隨著高血壓、高類固醇和抽煙等危險因子，但是這些因子僅和部分遺傳疾病類型有關。於是開始有人將研究CVD發展機制的希望轉向遺傳學和基因體學，希望可以找到其他致病的相關因子。只是上述因子相互影響而無法確認相互關係。其中比較困難的是在一些家族遺傳疾病中所發現的對應遺傳證據也不一定和其臨近基因有直接的關係，更不用說去釐清遺傳因子和環境因子的相互影響的關係。  

定序的技術不僅讓英國科學家 Frederick Sanger 於諾貝爾化學獎梅開二度外，亦深深奠定往後次代定序 (Next- generation sequencing, NGS) 的基礎，此項技術將生物、化學與電腦運算三者整合為一，徹底改變多樣化的基因組應用，更帶來劃時代進展，其目的無非是將生物體內大量的有字天書作趨近於完美的詮釋。為了因應大量序列數據的辨認，因此發展出條碼系統(Barcode system)，拜此辨識概念的引入，即允許混合多數樣品並於同時間進行大量定序(Bystrykh, 2012)，本文主要探討條碼對於次代定序的貢獻，從日常生活的有形化乃至生技層面的無形化，比比皆是，隨處可尋條碼的蹤跡，可見其對於人類生活息息相關，以下分三部分做詳細介紹：

壹、日常生活應用

    日常生活中常見的有形條碼，舉凡商業應用，如：物流管理的識別系統，超商貨品盤點的便利性與其結帳的效率性，再再都顯示條碼的辨識功能強大。條碼不僅即時性高且錯誤率低，更可連結電腦，達到系統性的自動化整合管理，亦是一種全球統一化的圖像語言。近年來，更在智慧型手機的意識形態裡，將商品、餐飲美食與旅遊的廣告宣傳等，取代成二維條碼的黑白小方塊圖像(如圖一所示，擷取自Liu et al., 2012)，以手機掃描條碼圖示，輕鬆得到豐富又經濟實惠的資料訊息，達到秀才不出門能知天下事的便利生活。

近幾年來肺癌成為前十大癌症死亡率最高，原因是現今社會中由於空氣汙染嚴重、二手菸或是因為工作關係長期處在於大型廢氣排放設備的工作區域等等，又加上肺臟本身沒有痛覺神經，所以當發現肺部有異狀時通常癌症已經轉移到淋巴或其他組織。

肺癌與其他癌症的治療方法不外乎就是化療、標靶等等，而近年來國內掀起一陣風潮，就是由基因定序來協助治療肺癌。在2010.09.14的中時健康網(http://health.chinatimes.com/contents.aspx?cid=6,60&id=11649)曾報導過，台北醫學大學附設醫院透過國內外文獻，推出全台首創肺癌基因定序篩檢，癌症患者只要透過基因篩檢就可以找到最適合自己的治療方式或是藥物使用，這樣一來不僅可以對症下藥還可以減少一些治療的時間。在國外早就在2008年Campbell等人在文獻中提利用全基因體定序協助肺癌的研究，接著分別在2010年與2011年陸陸續續都有相關的文獻出爐，如下表

由上表中的main finding可得知，目前找到與肺癌相關的突變點已達到非常多，相信在未來全基因體定序不僅在於學術研究，而是更廣泛應用在臨床診斷與治療並且對於醫療方面會有加乘作用。

我們對於數位資訊儲存媒體的容量需求一直不斷地增加. 以硬碟容量而言, 從30年前一顆數十MB, 到今日一顆數TB的硬碟, 儲存的密度可以說增加了數十萬倍. 即使有如此大的進步, 我們對於更大容量的儲存設備還是有需求.

自從1988年, 開始有人提出利用DNA作為儲存媒體的想法. 目前為止, 將資訊儲存於DNA上的資料量僅止於7,920位元(990位元組, bytes).  近年來由於NGS技術的發展, 使得DNA儲存媒體的技術也相對有很大的進步. 在最近一期的科學期刊, Church等人結合了NGS的技術, 將資料的儲存量提高到5.27百萬位元(相當於66萬位元組, 660 Kbytes), 約上一代技術660倍的增加.

    次代定序( Next- generation sequencing, NGS ) 的技術自發展以來，應用層面相當之廣泛，舉凡：學術研究、醫學檢測、藥品查驗以及考古起源等…，日新月異的定序技術發展之下，使得原本躓礙不前的考古科研有另一層突破性進展，本篇主旨探討利用NGS 巧妙的運籌帷幄，一窺歷史的跡象，揭開對古代生物迷思。古人曾云：「以史為鏡，可以知興替」。古老生物的遺傳密碼在NGS 抽絲剝繭下，間接了解生物演進，這些遠古的遺傳物質aDNA ( ancient DNA ) 經長年累月的歲月摧殘，會產生一些自發性的變異及損壞 ( 如：氧化、水解與 DNA crosslink )，或因外發性的降解 ( 如環境中的微生物所分泌核酸水解酵素，直接崩解 DNA 結構)。形成aDNA 三個主要特性：短片段、嘌呤丟失作用( depurination ) 與去胺基作用( deamination ) (Sawyer et al., 2012)，亦在先前之『利用NGS觀察DNA降解現象』一文中，詳細敘述相關的發生過程及原理，但這些現象往往左右定序的正確性，容易造成鹼基配對錯誤 ( misincorporation 或稱 miscoding lesions ) 現象，導致產生錯誤的序列訊息，以下就由三方面的研究作介紹。

壹、遠古動物的研究方面：

    Stiller 等學者在 2006 年的研究，發現猛瑪象的 aDNA 序列，有以下現象：一、異類鹼基置換 ( transversion )：嘧啶與嘌呤間的置換，二、同類鹼基置換(transition)：嘌呤之間或嘧啶之間的取代，造成定序的潛在誤配 (圖一)，也因為有NGS的大量定序，顛覆研究古代基因組的模式，跳脫以往對於DNA的配對概念。另外，從時間角度來看，aDNA 的變化不易隨時間推移，而增加片段的瑣碎程度，Sawyer等學者觀察從幾十年一直到幾萬年的粒腺體DNA ( mitochondrial DNA, mtDNA ) 片段平均大小，研究發現似乎無太大差異，如紅點所示幾乎都集中分佈在40至100 bp的片段範圍(圖二)。