作者：林志鵬/有勁基因

 

　　讀者們乍看這個標題可能以為作者最近失業要改行寫恐怖小說了。不過，本文真的跟血很有關…。主要是因為近年來液態切片的延伸應用越來越熱門，像「腫瘤細胞的基因突變偵測」以及「非侵入性產前染色體篩檢」都是(請參考有勁部落格文章《液態活檢與深度學習的2018年市場趨勢》)。雖然液態切片這個技術僅須抽取少許的血即可提供人們安全方便的檢測，可是當要用來檢測血液中量很稀少的腫瘤細胞游離DNA(cfDNA; cell-free DNA)時，不免心中會浮現一個疑問：假如病人的腫瘤細胞游離DNA只佔了血液檢體中游離DNA總含量的0.1％，那麼，究竟需要抽取病人多少血才能順利偵測腫瘤細胞游離DNA呢？

 

　　回答這個問題之前，我們必須先知道人類細胞的DNA有多重。人類染色體為雙套(diploid)，每套都帶有3x109 個鹼基對(bp; base pair)，而一個鹼基對的平均分子量為660 (AVGed MW of 1 bp)，一個質子的重量為1.67x10-12(pg; picogram; weight in Dalton)；因此我們可以從以下公式算出染色體的重量：2(diploid) x 3x109 (bp) x 660 (MW) x 1.67x10-12(pg) = 6.6pg。假設有一顆腫瘤細胞其游離DNA比例佔血液檢體中總游離DNA含量的0.1％，我們套入公式計算後，發現至少得採集到總游離DNA重量達6.6pg / 0.1% = 6600pg = 6.6 ng的血液檢體，才有可能將那顆腫瘤細胞的DNA完整取得並進行檢測。

 

　　上述的計算公式是假設「拿到一顆腫瘤細胞的游離DNA，就能在足夠的正確率下完成檢測」。不過，其實在做檢測資料分析判讀時，通常都會希望染色體變異能在多顆腫瘤細胞都被檢測到。這個時候該怎麼做呢？我們可以搭配「分子條碼」技術(請參考有勁部落格文章《QIAseq DNA Targeted Panel─偵測低頻DNA變異的新產品》)來協助辨識及排除DNA在PCR增殖及定序過程中所產生的錯誤，藉由辨識哪些讀序(reads)帶有相同的分子條碼，以便刪除重複的資料(de-duplication)，讓每一筆定序資料所呈現的都是來自同一顆腫瘤細胞的DNA分子。假如我們希望能在至少兩顆腫瘤細胞(也就是兩筆定序資料)上都找出相同的染色體變異，那麼，血液檢體中的游離DNA總重就至少得有6.6ng*2 = 13.2ng才足以偵測到那比例僅有0.1％的腫瘤細胞游離DNA。

 

　　然而，以上的估算還沒計入實驗操作過程中所有可能問題所帶來的誤差損失(例如：人為操作問題、後續DNA capture擷取或PCR增殖的反應效率不佳造成腫瘤游離DNA耗損…等等)，因此實際上需要的血液檢體量其實更多….

 

　　一般來說，我們抽取一管血的體積大約為10ml，經過游離DNA實驗萃取步驟後，大約可以取得5-20ng的游離DNA總量。根據ThermoFisher官方提供的資料1，假如想從血液檢體中偵測到比例只佔游離DNA總量0.1％的腫瘤細胞游離DNA，官方建議血液檢體必須要能提供總量達20ng的游離DNA才夠用，如圖一所示。因此，如果能抽滿一管10ml的血液檢體，或許剛好可以通過需求標準。但是為了保險起見，建議還是採集兩管血比較恰當。

 

圖一、肺腫瘤游離DNA分析(Oncomine Lung cfDNA Assay)定序與輸入所要求的偵測極限範圍在0.05%與0.7%之間

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這張圖的X軸代表偵測的極限，範圍在0.05％到0.7％之間。右邊的Y軸則代表需要提供的游離DNA(cfDNA)總量。由圖我們可以看到，游離DNA總量大約在20ng左右時，偵測能力可以達到0.1％。(圖片來源：ThermoFisher Scientific. (2016). Oncomine Lung cfDNA Assay and Ion S5 XL System: Next-generation sequencing analysis of low-frequency mutations from cell-free DNA.)

 

 

　　寫到這裡，作者不由得想起前陣子爆紅又迅速跌落谷底的Theranos；這家公司宣稱只要一滴血就能準確快速地篩檢300多項指標，其中當然也包括癌症篩檢。雖然事後我們知道這一切都是騙局，但我們不由得也好奇是否真有機會從一滴血裡的游離DNA偵測到癌細胞染色體變異呢？根據Wiki提供的數據2，「一滴」的定義大約是0.05ml。為了方便計算，我們假設10ml的血液檢體可以取得總重10ng的游離DNA好了，這樣的話，一滴血估計可以取得的游離DNA總量最多只有0.05ng (50pg)。因此，除非腫瘤細胞游離DNA佔了所有游離DNA的13.2%(＝6.6pg/50pg)以上，否則根本就無法被偵測出來。(這裡需要再次強調，這個計算公式，尚未考慮染色體變異應要在多顆腫瘤細胞同時被偵測到，以及實驗操作過程中所有可能問題所帶來的誤差損失…。)

 

　　相信各位讀者看完本篇文章後，應該會覺得這篇文章充滿數字、公式及圖表，非常的枯燥乏味。作者也瞭解「發文不附圖，此風不可長」的道理。為了提昇點閱率，下面就用Theranos執行長伊莉莎白·霍姆斯(Elizabeth Holmes) 的一張優雅照片3來結束這回合好了。

 

圖二、Elizabeth Holmes以及她手上的一滴血 (聽說她為了塑造自己的形象，終年穿著黑色高領毛衣，因此室內空調永遠都設定在攝氏15度)

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圖片來源：HBO. (2019 Jun 17). The Inventor: Out for Blood in Silicon Valley.

 

 

 

參考文獻

1.ThermoFisher Scientific. (2016). Oncomine Lung cfDNA Assay and Ion S5 XL System: Next-generation sequencing analysis of low-frequency mutations from cell-free DNA. Retrieved from http://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/ngs-analysis-mutations-cfdna-app-note.pdf

2.Wikipedia. Drop (unit). Retrieved from https://en.wikipedia.org/wiki/Drop_(unit)

3.HBO. (2019 Jun 17). The Inventor: Out for Blood in Silicon Valley.  Retrieved from https://www.hbo.com/documentaries/the-inventor-out-for-blood-in-silicon-valley

 

 

 

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    細胞游離DNA cell-free DNA 血檢中腫瘤細胞游離DNA的佔比 腫瘤細胞游離DNA在血檢中的含量 計算血液檢體量
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