有勁的基因資訊

作者：鄭翰欽/有勁基因

　　細菌，一般人總會聯想到會帶來疾病與不適(如上吐下瀉、肺炎、破傷風、腦膜炎等)，甚至還會奪走人們的性命；然而，細菌同時也促進了人們的生活品質。在醫療方面，對抗細菌感染的青黴素就是來自青黴菌；食品方面，人們常吃的優酪乳、優格都是由乳酸菌等發酵而成。只是，不論細菌在人們生活上能提供多大的幫助，還是別忘記，使用不當仍然會影響身體健康的；因此針對細菌產物，衛生品管單位仍需透過一系列檢測，證明其安全無虞後才能放行。例如：美國的Ganeden^® Biotech公司想要將Bacillus coagulans GBI-30, 6086 (GanedenBC30) ³這株菌加到配方奶粉內，就得先通過美國食品藥品管理局(FDA; U.S Food and Drug Administration)的公認安全標準(Generally recognized as safe, GRAS) ¹ 才行。在GRAS的眾多標準中，其中一項就是要確認菌種本身沒有抗生素抗藥性(antibiotic resistance)的基因。一般常見的確認方法是將該菌種的蛋白質序列拿去比對抗生素抗藥性的資料庫，以證明其不帶有相關的基因。

　　眾多抗生素抗藥性的資料庫中，比較有名的是抗生素抗藥性綜合資料庫(CARD; The Comprehensive Antibiotic Resistance Database)²。CARD資料庫最核心的部分為Antibiotic Resistance Ontology (ARO)。每一個ARO索引裡的項目「term」就是代表一個抗生素抗藥性。在ARO term的說明頁中(如圖一所示)，使用者可以看到這個ARO term的ID編號與定義。。若想看看有哪些基因是和這個抗生素抗藥性有關的，可以選擇頁面上方的「Download sequence」去下載查看。倘若不知道ARO編號，只記得關鍵字的話，則可在右上角的搜尋框(search)中，輸入關鍵字進行搜尋。

圖一、Antibiotic Resistance Ontology (ARO) term與資料頁面

(圖片來源：JIA, Baofeng., et al. Nucleic Acids Research. 2016 Oct; 45(D1):D566-D573.)

　　對使用這個資料庫的人來說，他們最關注的當然是手上的菌株到底帶不帶有抗生素抗藥性的基因。為此，CARD提供了兩個分析工具給使用者：NCBI(National Center for Biotechnology Information; 美國國家生物技術資訊中心)的序列比對軟體BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)、以及CARD官方所開發的RGI (Resistance Gene Identifier; 抗藥性基因識別程式)。這邊就以GanedenBC30³為例，利用這兩項分析工具去確定此菌株是否真的不具抗生素抗藥性基因。

　　BLAST分析工具，就是很單純的利用BLAST去做比對，看看GanedenBC30序列中有沒有什麼部分和哪個抗生素抗藥性序列很相似的。將序列上傳之後，BLAST就會給出與其最接近的抗生素抗藥性基因和雷同分數。結果是，GanedenBC30這個菌株的序列並沒有和任何一個抗生素抗藥性基因雷同。

　　RGI，則是會針對基因組序列進行開讀框(Open Reading Frame; ORF)預測，並會比對這些ORF與哪個抗生素抗藥性基因序列最為相似；最後再將結果以表格和圖片的方式呈現出來，然後說明這個基因組中可能含有哪些和抗生素抗藥性雷同的序列。至於GanedenBC30這個菌株，並未比對到和任何抗生素抗藥性基因類似的序列(圖二、圖三)。

圖二、RGI分析表格範例：GanedenBC30 

如圖所示，Bacillus coagulans GBI-30, 6086 (GanedenBC30)並未被檢出含帶和抗生素抗藥性基因雷同的序列，是故表格內並沒有列出檢出結果。(表格來源：JIA, Baofeng., et al. Nucleic Acids Research. 2016 Oct; 45(D1):D566-D573.)

圖三、RGI分析圖範例：GanedenBC30 / Plamid pNDM-HK vs. AMR gene family

RGI分析結果，除了表格之外，也會以圖片的方式來呈現。在這裡是以抗生素抗藥性基因AMR gene family作為示範。上圖為Bacillus coagulans GBI-30, 6086 (GanedenBC30)的檢測結果；下圖為Escherichia coli HK-01 plasmid pNDM-HK (Plamid pNDM-HK)^(註一)的檢測結果。門檻的部分（見上圖），由嚴到鬆依序為Perfect, Strict, Loose。Perfect是指序列與資料庫中的序列完全符合；Strict為序列與資料庫中的序列有絕大部分相同；Loose則是指只有部分序列與資料庫中的序列相同。下圖由內而外的四個圈，依序代表中心點、門檻、類別、hit數；藉此圖來呈現此菌株在各個門檻之下有比對到哪些抗生素抗藥性基因的類別，比對到的基因數又有多少。若結果是未檢出，就不會出現類別與hit數這兩項資料。(圖片來源：JIA, Baofeng., et al. Nucleic Acids Research. 2016 Oct; 45(D1):D566-D573.)

        透過CARD的分析，我們得知GanedenBC30這株菌並沒有抗生素抗藥性基因；換句話說，這株菌算是我們可以掌控的。當然，可控仍並不代表絕對安全；是否真的安全無虞，仍須藉由諸如毒性試驗等等其他試驗確認後才能得知。

註一：此序列範例來自CARD。

參考文獻

1. Food and Drug Administration (FDA). (2016 Jul). Notice to US Food and Drug Administration that Bacillus Coagulans GBI-30, 6086 is Generally Recognized as Safe for Use in Non-Exempt Term Infant Formula. Ohio: Ganeden Biotech Inc. Retrieved from https://www.fda.gov/media/100025/download

2. JIA, Baofeng., et al. CARD 2017: Expansion and Model-Centric Curation of the Comprehensive Antibiotic Resistance Database. Nucleic Acids Research. 2016 Oct; 45(D1):D566-D573. Retrieved from https://doi.org/10.1093/nar/gkw1004

3. National Center for Biotechnology Information (NCBI). (2017, Nov 11). GCF_000756285.1_ASM75628v1. [FTP file]. Retrieved from ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/756/285/GCF_000756285.1_ASM75628v1