有勁的基因資訊

作者：吳上豪/有勁基因

        有勁基因實驗室獲TAF的認證，實驗操作有一定的品質保證；但客戶的樣品五花八門，實驗過程中難保不會出現異常的狀況。筆者在這裡透過前陣子收到的一個阿拉伯芥RNA定序案件，想和大家分享該案件從樣品最初的品質檢測到後續文庫製備的過程中一些相當值得討論的資訊。

        分享這個案件之前，先來簡單介紹建置RNA文庫前所需要的背景知識。分子生物學所說的「遺傳訊息傳遞/基因表現的中心法則」是指DNA經過轉錄得到RNA，RNA再經轉譯合成蛋白質，蛋白質則在轉錄、轉譯以及DNA自我複製的流程中扮演協助的角色。RNA依其功能不同，種類也有所不同，比如大家熟知的mRNA、tRNA和rRNA，其中rRNA占比最高，占了近8成。除此之外，有一些RNA還能調控基因表現，例如短片段的small RNA、micro RNA，或長片段但不會轉譯成蛋白質的non-coding RNA。一般來說，想觀察一個生理反應中不同基因有哪些表現，其表現程度與相互控制的關係如何時，都會針對RNA去進行定序。

　　這個案例是這樣的：客戶在確認實驗項目與細節後，將阿拉伯芥葉片的RNA樣品送給我們的基因實驗室進行分析。根據TAF標準作業流程的規範，實驗室收到客戶樣品後都必須先確認RNA樣品的品質，符合標準的樣品才能進入文庫製備的流程。而RNA樣品品質有沒有達標，最重要的判斷依據就是確定樣品是否有發生降解的現象；因此所有樣品都會進行微流體晶片檢測，以確認降解的狀況。

　　前面有提到rRNA佔了整體RNA的近8成，也就是說，製備文庫之前，在跑電泳或微流體晶片檢測RNA品質時所觀察到的訊號通常都是來自rRNA，因此一般來說，從rRNA的圖譜便可大致判斷出樣品的降解程度。但是，植物葉片的樣品較特別。從下圖一的圖譜比較，可以看到阿拉伯芥葉片相較於人類多出許多條訊號，這些訊號其實是來自葉綠體，既不是雜訊也不是RNA降解或汙染所造成。由於葉綠體內帶有類似原核生物的RNA，因此若RNA的來源樣品含有葉綠體，其圖譜就有可能出現許多額外的條帶，大家可千萬不要誤以為是RNA降解就隨便丟掉。

圖一、阿拉伯芥葉片與人類的RNA微流體晶片檢測結果比較

圖片來源：吳上豪/有勁基因

　　製備文庫時，如果將所有的RNA直接拿去用，rRNA顯然會佔據許多資料空間；所以在進入RNA文庫製備之前，還必須想辦法先去除rRNA的影響才行；這個部分目前常見的做法有兩種，一是利用探針直接抓出mRNA，以便製備文庫；二是先用探針抓出rRNA，去除後，再將剩下的RNA拿去進行後續的文庫製備，方法二又稱為「rRNA depletion (rRNA去除法/耗竭法)」。詳見表一。

表一、移除rRNA常見的方式介紹

表格來源：Zhao, S., et al. Sci Rep. 2018 Mar; 8:4781.

　　這位客戶想觀察阿拉伯芥葉片的轉錄體表現，因此選擇使用rRNA depletion的方式對total RNA先進行處理。然而正當客戶為了辛苦取得的樣品通過文庫製備的品質要求而高興時，我們卻發現該樣品在去除rRNA後，仍可觀察到一個不明的異常訊號(如下圖二所示)，請問這時應該要無視這個訊號繼續進行文庫製備，還是應該再做一次rRNA depletion，去除rRNA呢？

圖二、去除rRNA後進行的微流體電泳結果

橫軸1,2是未去除rRNA前的樣品(非植物葉片來源)，3~6是rRNA去除處理成功的樣品，7~12是該客戶的阿拉伯芥葉片樣品，紅框標記處為出現異常訊號的位置。(圖片來源：吳上豪/有勁基因)

        一般來說，若試劑選擇正確且確實按指示操作，99%以上的rRNA都可被去除掉²。阿拉伯芥葉片這個案例，圖二異常訊號的所在位置，經比對發現相當接近圖一23S rRNA的位置，因此難以確定rRNA是否真的有被完全去除。這個問題很令人頭痛，畢竟製備文庫跟定序的開銷都為數不小，如果無視異常訊號繼續下去，出了問題，損失很大。最後我們決定先取其中兩個樣品去製備文庫跟定序，分析資料中是否仍殘留著rRNA，再來決定後續策略。定序完成後客戶根據數據進行分析，從表二的分析結果來看，rRNA幾乎已完全被去除，而這個不明訊號的真實身分，看起來很可能來自和光合作用有關的光反應中心或酵素基因。這些大量表現的基因相較於rRNA，訊號並不強；但在rRNA被去除後，這些基因的訊號反而變成最顯眼，因此才被觀察到。遇到像這類RNA樣品在去除rRNA後仍觀察到異常訊號的情況，建議大家可先評估抽取RNA的那個時間點是否剛好有某基因的大量表現、並先確認該表現基因的長度，然後再比對電泳膠圖，判斷異常訊號究竟是來自未完全去除的rRNA，還是來自某時間點大量表現的mRNA。

表二、定序後的序列分析結果，僅列出比例最高的前5個基因

rRNA已幾乎不存在，佔比最高的是與光合作用相關的基因。(表格來源：吳上豪/有勁基因)

　　本文所分享的這個案件，透過實驗室和客戶之間多次的討論與實驗分析，最後順利解決，皆大歡喜，在此提供作為參考。這裡建議，實驗過程中若在任何地方遇到異常狀況，不妨回頭小心觀察，分析異常狀況如何而來，如此便可解決許多問題；而且這些經驗還能化為知識，未來可以幫助我們在實驗中更快速地做出正確的判斷。

參考資料

1. Zhao, S., et al. Evaluation of two main RNA-seq approaches for gene quantification in clinical RNA sequencing: polyA+ selection versus rRNA depletion. Sci Rep. 2018 Mar; 8:4781. https://doi.org/10.1038/s41598-018-23226-4

2. Caruccio, N., et al. (2012 Feb) Enhanced RiboZero™ Technology: Expanded Removal of Ribosomal RNA and Improved RNA-Seq Library Quality. 2012 Advances in Genome Biology and Technology, Marco Island, Florida, USA. Retrieved from http://www.epibio.com/docs/default-source/scientific-posters/2012-agbt---enhanced-ribozero-technology---expanded-removal-of-ribosomal-rna-and-improved-rna-seq-library-quality.pdf?sfvrsn=8