有勁的基因資訊

作者：許柏洋/有勁基因

　　武漢肺炎來勢洶洶，疫苗何時問世成為大家關注的焦點之一。病毒疫苗，除了傳統疫苗開發方式外，近年興起的基因編輯技術CRISPR/Cas9^備註1也開始被拿來研究應用。病毒，由於其基因體很小，要入侵宿主時往往需要利用宿主細胞上的一些「因子(factor)」，才能順利入侵、複製及傳播；這些宿主細胞上的因子又稱為宿主倚賴性因子(HDF; Host dependency factor)。CRISPR/Cas9基因編輯技術可用來找出並刪掉這些宿主倚賴性因子，藉由降低病毒的入侵感染能力來防治疾病。CRISPR除了被用來阻止病毒感染，也經常應用在預防寄生蟲感染和防止腫瘤惡化等研究上。本文將介紹中國廣東省熱帶疾病研究重點實驗室利用CRISPR尋找弓漿蟲宿主細胞上倚賴性因子的研究成果¹。

　　弓漿蟲是一種為人熟知的寄生蟲，可寄生於家禽如貓，並有機會感染貓咪的飼主。初次被弓漿蟲感染的貓咪其糞便中可能帶有蟲卵，孕婦在孕期內若是首度被感染，就有可能傳染給胎兒^備註2。胎兒在懷孕初期被感染的機率並不高，但是一旦被感染，就可能會導致流產或畸胎等嚴重後果。目前，飼主只要透過IgG及IgM兩種抗體的血液檢測便可知道是否曾受過、或最近是否有被弓漿蟲感染。

　　中國廣東的研究團隊的研究先是取得慢病毒基因編輯資料庫(lentiviral CRISPR-Cas9-sgRNA library)，該資料庫將19,050個人類基因和1,864 個pri-miRNA(primary microRNA)，每個基因和每個miRNA分別以6個及4個sgRNAs(單股嚮導RNA；single guide RNA)進行標靶。然後利用慢病毒載體將sgRNA和Cas9酵素帶進人類包皮纖維母細胞(HFF; Human foreskin fibroblasts)中，Cas9酵素被引導至目標後就會剔除該標靶基因。之後再用弓漿蟲去感染這些細胞，將倖存的細胞篩選出來，然後定序其內的sgRNA並確認相關重點基因。（請見圖一）

圖一、宿主倚賴因子(Host dependency factors, HDFs)的篩驗流程圖

圖片來源：Wu, S.Z. et al. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2020 Jan; 9:460.

　　在三次重覆實驗後，研究團隊找出1,183個基因和10個pri-miRNA為可能的宿主倚賴性因子，其中也包括現今已知的弓漿蟲宿主倚賴性因子之一「表皮生長因子受體(EGFR)」。為了驗證，該團隊從中選出7個基因並利用siRNA(small interfering RNA；短小干擾RNA)進行實驗；結果證實在抑制這7個基因表現的情況下，弓漿蟲的增殖顯著減少了。

　　研究團隊同時也利用基因功能分類分析(GO; Gene Ontology)以及京都基因與基因組百科全書(KEGG; Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)研究這些因子的功能及之間的相關性。1,183個基因中有428個基因的功能具高度相關性，而其他的基因也各自互有關聯。這些研究證明CRISPR所篩選出的基因並非隨機選出，而是確實具有相關性；例如本研究，其相關之處就是弓漿蟲的宿主倚賴因子。

　　本文所介紹的這個研究雖然尚未能臨床應用在人體上，但CRISPR及宿主倚賴性因子的研究為科學家指出了防治病原的另一項選擇。搭配次世代定序系統的高通量輸出，CRISPR有機會快速大量地幫忙找出與疾病防治有關的潛在因子，未來在致病機制及疫苗開發上可望提供不少幫助。

備註1：CRISPR/Cas9全名為：Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/ CRISPR associated protein 9；常間回文重複序列叢集關聯蛋白。

備註2：弓漿蟲感染免疫功能正常的人通常不會產生嚴重的症狀，且人跟貓感染後會產生終身免疫。因此孕婦在懷孕期間若不是初次感染弓漿蟲的話，病原垂直感染給胎兒的機會並不高(媽媽體內有抗體)。貓咪也是只有在初次感染弓漿蟲時，糞便中才會帶有蟲卵。

參考文獻

1.Wu, S.Z. et al. Genome-Wide CRISPR Screen Identifies Host Factors Required by Toxoplasma gondii Infection. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2020 Jan; 9:460. https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00460