有勁的基因資訊

作者：何胤嫻/有勁基因

　　次世代定序技術中可左右錯誤率的重要步驟，除了能降低定序錯誤率的「定序平台優化」外，還有基因文庫的製備方式；因此一直都有不少科學團隊致力開發更好的文庫製備流程。2021年4月，Nature期刊刊登了一篇英國團隊的研究，內容涵蓋新的研究觀點，還有他們新開發的定序技術—Nanorate Sequencing(NanoSeq)¹。

　　2016年，美國Hoang, M.L.團隊在PNAS發表了採用Duplex sequencing原理²的BotSeqS技術³；而2021年英國Wellcome Sanger Institute團隊的NanoSeq技術則是將BotSeqS技術進一步改良。由於Duplex sequencing定序結果所產生的錯誤大部分都出現在DNA片段的末端，代表那些錯誤很可能是在文庫製備過程中發生；如圖一(A)所示，小片段DNA因末端被修復或是末端缺口延伸而發生錯誤的複製。因此，NanoSeq技術使用專一性更高的限制酶去將雙股DNA切成片段，然後在小片段DNA的末端連接了去氧核苷酸三磷酸(dATP/ddBTP)，以終止缺口延伸，避免錯誤的複製，如圖一(B)所示。除此之外，NanoSeq技術也配合了一套新開發的生物資訊分析流程，減少定序時所產生的錯誤，讓錯誤率降至10億個鹼基中只有不到5個錯誤的發生機會。

圖一、NanoSeq原理

(A)BotSeqs採用的是Duplex sequencing原理，小片段DNA因末端被修復或是末端缺口延伸而發生了錯誤的複製。(B)NanoSeq則是將BotSeqs技術加以改良；在限制酶將雙股DNA打斷後於缺口處接上dATP或是ddBTP，以終止缺口延伸，避免錯誤的複製。(圖片來源：Abascal, F., Harvey, L.M.R., Mitchell, E. et al. Nature. 2021 Apr;593:405–410.)

　　英國Wellcome Sanger Institute團隊接著利用NanoSeq技術去進行血液、結腸及肌肉等樣品的研究，發現基因突變率在非分裂狀態的神經細胞與較常分裂的結腸細胞之間差異並不顯著，這與以往我們認為突變是發生在細胞分裂過程的觀點截然不同，表示突變也有可能是由細胞分裂過程之外的其他生物機制所造成。

　　體細胞突變是驅動癌症發生的重要機制，也是導致衰老或其他疾病的可能原因，NanoSeq這個新技術便可望為這些方面的研究打開新視野。此外，NanoSeq除了可以研究任何組織中的細胞突變，也具備準確偵測DNA單分子的能力，現今的非侵入性採檢可以比以往更安全地做到活體採檢，因此NanoSeq也有機會被更廣泛應用在活體檢體的研究領域上。

參考文獻

1. Abascal, F., Harvey, L.M.R., Mitchell, E. et al. Somatic mutation landscapes at single-molecule resolution. Nature. 2021 Apr;593:405-410. Retrieved from https://doi.org/10.1038/s41586-021-03477-4

2. Kennedy, S., Schmitt, M., Fox, E. et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat Protoc. 2014 Nov;9:2586-2606. Retrieved from https://doi.org/10.1038/nprot.2014.170

3. Hoang, M.L., Kinde, I., Tomasetti, C. et al. Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal human tissues using massively parallel sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Aug;113(35):9846-9851. Retrieved from https://doi.org/10.1073/pnas.1607794113