為確保育種者的智慧財產權避免侵權事件、檢測作物是否為混合品種與協助追查農產品走私等皆需進行作物品種鑑定,因此良好的鑑定技術將有助於作物品種鑑定。

 

近年來國內已有多個單位透過簡單重複序列分子標誌多型性分析進行作物品種鑑定,以下針對簡單重複序列進行相關說明:

簡單重複序列 (simple sequence repeat) 簡稱SSR,又可稱為微衛星序列 (microsatellite),是一種以2~6個核苷酸為一個 motif 的重複性序列,普遍存在於所有原核與真核生物基因體 (genome) 中。簡單重複序列於單一基因座 (single locus) 具有多重對偶基因 (multiple alleles) 與共顯性 (codominance) 遺傳的特性,此外簡單重複序列motif發生突變的機率相較於基因體的其他區域高,促使簡單重複序列於每個個體間存在著高度的變異性進而造就簡單重複序列成為鑑別度良好的分子標誌。

 

如何選殖 (isolation) 簡單重複序列:

近年來已有許多文獻證實次世代定序 (next-generation sequencing) 可有效的確認特定作物基因體 (genome) 與轉錄基因體 (transcriptome) 中簡單重複序列的位置與數量,並進一步設計可以放大特定 SSR 分子標誌的引子 (primer) ,以利之後進行簡單重複序列多型性分析與作物品種鑑定。

 

如何利用次世代定序進行簡單重複序列分子標誌多型性分析與作物品種鑑定:

一、高覆蓋率全基因體定序 (Whole genome sequencing)與序列組裝 (De novo assembly):

此方式為將不同作物的基因體 (genome) 隨機片斷化 (random fragmentation) 並進行基因庫 (library) 的製備後,分別進行100倍覆蓋率 (coverage) 的定序並將獲得的序列資料進行全基因體序列組裝,再透過特定的程式選殖全基因體序列上所有的簡單重複序列。

由於此種定序方式可獲得全基因體序列與所有的簡單重複序列分子標誌,故可應用於鑑定兩樣品是否為相同品種與鑑定兩樣品是否為不同品種。

二、低覆蓋率全基因體定序 (low coverage whole genome sequencing):

        此方式為將不同作物的基因體隨機片斷化並進行基因庫 (library) 的製備與低覆蓋率搭配較長的定序長度進行定序,再透過特定的程式選殖基因庫序列上所有簡單重複序列的位置與數量。

        由於此種方式可同時獲得多種簡單重複序列分子標誌,故可應用於鑑定兩樣品是否為不同品種。

三、豐富性簡單重複序列基因組基因庫定序 (SSR- enriched genome library sequencing):

此方式為將不同作物的基因體隨機片斷化並進行基因庫 (library) 的製備,再以特定的探針 (probe) 篩選出具有簡單重複序列的基因庫後進行低覆蓋率搭配較長的定序長度進行定序,最後再透過特定的程式選殖基因庫序列上所有簡單重複序列的位置與數量。

雖然此種定序方式可能會喪失探針未選殖到的特定簡單重複序列,但仍可獲得大量的簡單重複序列分子標誌,故仍可應用於鑑定兩樣品是否為不同品種。

 

 

參考文獻:

  1. Zalapa JE, Cuevas H, Zhu H, Steffan S, Senalik D, Zeldin E, McCown B, Harbut R, Simon P. Am J Bot. (2012) 99:193-208. Using next-generation sequencing approaches to isolate simple sequence repeat (SSR) loci in the plant sciences.
  2. Silva PI, Martins AM, Gouvea EG, Pessoa-Filho M, Ferreira ME. BMC Genomics. (2013) 14:17. Development and validation of microsatellite markers for Brachiaria ruziziensis obtained by partial genome assembly of Illumina single-end reads.
  3. Rakoczy-Trojanowska M, Bolibok H. Cell Mol Biol Lett. (2004) 9:221-238. Characteristics and a comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants.
  4. Sawicki J, Kwaśniewski M, Szczecińska M, Chwiałkowska K, Milewicz M, Plášek V. Int J Mol Sci. (2012) 13:7586-7593. Isolation and Characterization of Simple Sequence Repeats (SSR) Markers from the Moss Genus Orthotrichum Using a Small Throughput Pyrosequencing Machine.
  5. Davey JW, Hohenlohe PA, Etter PD, Boone JQ, Catchen JM, Blaxter ML. Nat Rev Genet. (2011) 12:499-510. Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation sequencing.
  6. http://gmo.agron.ntu.edu.tw/report/finger.pdf

 

 

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